檢測原理:本試劑盒采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。將標準品、待測樣本加入到預(yù)先包被人纖連蛋白（FN）多克隆抗體透明酶標包被板中，溫育足夠時間后，洗滌除去未結(jié)合的成分，再加入酶標工作液，溫育足夠時間后，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根過氧化物酶（HRP）催化下轉(zhuǎn)化為藍色產(chǎn)物，在酸的作用下變成黃色，顏色的深淺與樣品中人纖連蛋白（FN）濃度呈正相關(guān)，450nm波長下測定OD值，根據(jù)標準品和樣品的OD值，計算樣本中人纖連蛋白（FN）含量。

組成：

1 酶標包被板12 孔×8 條7 底物夜A 6mL

2 標準品：50ng/ml 0.6mL 8 底物夜B 6mL

3 20 倍濃縮洗滌液20mL 9 終止液6mL

4 標準品稀釋液6mL 10 說明書1 份

5 樣本稀釋液6mL 11 封板膜1 張

6 酶標試劑6mL 12 密封袋1 個

備注：標準品用標準品稀釋液依次稀釋為：50、25、12.5、6.25、3.12、1.56ng/ml

需要而未提供的試劑和器材：

1、37℃恒溫箱

2、標準規(guī)格酶標儀

3、精密移液器及一次性吸頭

4、蒸餾水

5、一次性試管

6、吸水紙

操作步驟：

1、準備：從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30分鐘。

2、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。

3、加標準品和待測樣本：取足夠數(shù)量的酶標包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，在標準品孔中加入標準品50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）；空白對照孔不加。

4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

5、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4 次（也可用洗板機按說明書操作洗板）。

6、加酶標工作液：每孔加入酶標工作液50μL，空白對照孔不加。

7、溫育：重復(fù)4 的操作。

8、洗板：重復(fù)5 的操作。

9、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B 液50μL，37℃避光顯色15min。

10、終止：取出酶標板，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（顏色由藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11、測定：以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長測量各孔的吸光值（OD值）。

12、計算：根據(jù)標準品的濃度及對應(yīng)的OD值，計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。zui終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)。

樣本要求：

1、樣本應(yīng)充分離心，不得有溶血及顆粒。

2、樣本不能含疊氮鈉（NaN3），因為疊氮鈉（NaN3）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑。

3、標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能立即試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注意事項：

1、實驗嚴格按照說明書的操作進行，實驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準。

2、酶標包被板開封后如未用完，應(yīng)立即裝入密封袋中加干燥劑保存。

3、建議所有的標準品、樣本和空白對照都做雙份檢測，取平均值，以減小實驗誤差。

4、牢記樣本已經(jīng)稀釋5 倍，計算結(jié)果乘以5 才是樣本實際濃度。

5、本試劑盒定量范圍為0.78-50ng/ml，超過此范圍，為標準曲線延伸計算所得，不做為準確定量結(jié)果，請用特殊稀釋液稀釋后測定準確結(jié)果（0.78-50ng/ml范圍內(nèi)），乘以總稀釋倍數(shù)即為樣本zui終濃度。

6、若顯色過淺，可適當(dāng)延長底物溫育時間。

7、為避免交叉污染，標準品、樣本和空白對照每加一個就要更換一次吸頭；酶標工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分，要懸臂加樣，不得碰到微孔；不得重復(fù)使用封板膜。

8、試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用，不同批號的試劑不得混用。

9、底物B 對光敏感，避免長時間暴露于光下。

操作程序總結(jié):準備試劑，樣品和標準品加入準備好的樣品和標準品，37℃反應(yīng)30分鐘洗板4次，加入酶標試劑，37℃反應(yīng)30分鐘洗板4次，加入顯色液A、B，37℃顯色15分鐘加入終止液15分鐘之內(nèi)讀OD值計算。

貯藏:2-8℃，避光防潮保存。

有效期:6個月

人纖連蛋白（FN）定量檢測試劑盒（ELISA）

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