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人丙酮酸脫氫酶E1(PDH E1)ELISA試劑盒

時(shí)間:2011/12/29閱讀:553
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 人丙酮酸脫氫酶E1(PDH E1)ELISA試劑盒

人丙酮酸脫氫酶E1(PDH E1)ELISA試劑盒使用說(shuō)明書
人丙酮酸脫氫酶E1(PDH E1)ELISA試劑盒僅供研究使用
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿或其它相關(guān)液體中丙酮酸脫氫酶-E1含量。
實(shí)驗(yàn)原理:本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中丙酮酸脫氫酶-E1水平。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入丙酮酸脫氫酶-E1抗原、生物素化的抗人丙酮酸脫氫酶-E1抗體、HRP標(biāo)記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的丙酮酸脫氫酶-E1呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),計(jì)算樣品濃度。 
組成及試劑配制: 
1.酶聯(lián)板:一塊(96孔) 
標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品):2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,其濃度為100 nmol/L,做系列倍比稀釋后,分別稀釋成100 nmol/L,50 nmol/L ,25 nmol/L,12.5 nmol/L,6.25 nmol/L,3.12 nmol/L,1.56 nmol/L,其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度,樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 nmol/L,臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制50 nmol/L標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml 100 nmol/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
2.樣品稀釋液:1×20ml/瓶。
3.檢測(cè)稀釋液A:1×10ml/瓶。
4.檢測(cè)稀釋液B:1×10ml/瓶。
5.檢測(cè)溶液A:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測(cè)稀釋液A 1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制(每孔100ul),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
6.檢測(cè)溶液B:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測(cè)稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。
7.底物溶液:1×10ml/瓶。 
8.濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 
9.終止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。 
標(biāo)本的采集及保存:
1.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 
2.血清:標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
操作步驟:
實(shí)驗(yàn)開始前,請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?試劑或樣品稀釋時(shí),均需混勻,混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí),用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。
1.加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?00ul,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2.棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul(取1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時(shí)內(nèi)配制),37℃,60分鐘。
3.溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干。 
4.每孔加檢測(cè)溶液B工作液(同檢測(cè)A工作液) 100ul,37℃,60分鐘。
5.溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干。
6.依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。
7.依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
注:
1.每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。 
2.為防止樣品蒸發(fā),試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
3.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,請(qǐng)于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液或檢測(cè)溶液B工作液。
4.建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定,以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法:
1.自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
2.手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
計(jì)算:以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo)),OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。 
注意事項(xiàng):
1.洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。
2.一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
3.請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。
4.如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高,請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定,計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5.在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí),請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。
6.底物請(qǐng)避光保存。
特異性:本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人丙酮酸脫氫酶-E1,且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。
說(shuō)明:
1.在儲(chǔ)存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,試劑避免受到微生物的污染,因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。
2.小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。請(qǐng)注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,酶結(jié)合物或底物時(shí),*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大,將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時(shí)間,從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。而且,洗滌不充分將影響試驗(yàn)結(jié)果。
3.試劑盒保存:部分試劑保存于-20℃,部分試劑保存于2-8℃,具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn)。
4.濃洗滌液會(huì)有鹽析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。 
5.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。 
6.中、英文說(shuō)明書可能會(huì)有不一致之處,請(qǐng)以英文說(shuō)明書為準(zhǔn)。
7.所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。
8.有效期:6個(gè)月

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