初代細胞培養(yǎng)實驗

初代培養(yǎng)或原代培養(yǎng)，是從供體獲取組織后的培養(yǎng)。組織和細胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大的變化，具有二倍體遺傳性狀，在供體來源充分、生物條件穩(wěn)定的情況下（年齡、性別），在一定程度上能 反  映體內狀態(tài)。

 實驗方法原理

 消化培養(yǎng)法

 合成培養(yǎng)基胰蛋白酶消化培養(yǎng)法，能把組織塊分散成細胞團或單個細胞，便于細胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)和排出代謝產(chǎn)物，細胞能較快地長成單層。
  本法尤適用于培養(yǎng)大量組織，細胞產(chǎn)量高；但用于經(jīng)常性小量培養(yǎng)工作稍顯繁瑣，無菌操作不良時且易污染。

  實驗材料

  組織

  試劑、試劑盒

  Hanks  培養(yǎng)液 胰蛋白酶

 儀器、耗材

  吸管 平皿  培養(yǎng)瓶 燒杯 攪拌器 三角燒杯 眼科剪 眼科鑷 計數(shù)板

  實驗步驟

  1.  準備
  取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20 分鐘；
  2.  布局
  點燃酒精燈（或煤氣燈），安裝吸管帽（應通過火焰）；

  3.  處理組織
   把組織塊置入燒杯中，用Hanks液漂洗2~3 次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60 分鐘；
  4.  剪切
  用眼科剪把組織塊切成2~3 毫米大小的塊（用手術刀割亦可），以便于消化；加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞；
  5.  消化
  或用恒溫水浴，或置入37 ℃溫箱消化均可，消化中每隔20 分鐘應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好（消化前瓶中需置一無菌攪棒）；消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定；
  6.  分離
  在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊（必要時可繼續(xù)進行消化）；低速  （500~1000 轉/分）離心消化液5 分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液（如有其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks液洗脫一兩次后，再加入培養(yǎng)液）；
  7.  計數(shù)
  用計數(shù)板計數(shù)，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調整后，分裝入培養(yǎng)瓶中；對大多數(shù)細胞來說，pH 要求在7.2~7.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說膽液體變酸，可用NaHCO3調整；

  8.  培養(yǎng)
  置入36.5 ℃溫箱培養(yǎng)；如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽（松口）堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需更換新塞。