基因敲除技術(shù)

CRISPR技術(shù)

一、服務(wù)介紹

原核生物規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機(jī)制。CRISPR/Cas是新出現(xiàn)的一種由RNA指導(dǎo)Cas核酸酶對靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)。在這一系統(tǒng)中，crRNA（CRISPR derived RNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶定位點(diǎn)剪切雙鏈DNA達(dá)到對基因組DNA進(jìn)行修飾的目的。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于大小鼠基因的KO/KI模型制備。

二、基因敲除技術(shù)服務(wù)流程

1、gRNA載體構(gòu)建

2、gRNA和Cas9體外轉(zhuǎn)錄成mRNA

3、mRNA顯微注射（F0模型生產(chǎn)）

4、F1模型生產(chǎn)

三、CRISPR/Cas9技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢

1、可實(shí)現(xiàn)對靶基因多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)敲除。

2、實(shí)驗(yàn)周期短，順利情況下僅需2個(gè)月。

3、無物種限制。

TALEN靶向敲除技術(shù)

一、服務(wù)介紹

TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nuclease）技術(shù)是基于對DNA識(shí)別的TALEN臂和人工改造的核酸內(nèi)切酶的切割域（Fok I）的結(jié)合對細(xì)胞基因組進(jìn)行修飾而實(shí)現(xiàn)的。TAL的核酸識(shí)別單位由34個(gè)氨基酸組成，其與DNA序列結(jié)合的特異性取決于第12位和第13位氨基酸殘基（重復(fù)可變的雙聯(lián)氨基酸位點(diǎn)，RVDs）。RVDs和A、T、C、G就恒定的對應(yīng)關(guān)系，即NI識(shí)別A、NG識(shí)別T、NN識(shí)別G、HD識(shí)別C。因此，要識(shí)別特定的核酸序列，只需將TAL識(shí)別模塊按照對應(yīng)的核苷酸序列串聯(lián)組裝即可，通常會(huì)在目的基因中選擇兩處相鄰（間隔15-20個(gè)堿基）的靶序列（長度為16-20bp的DNA序列）分別進(jìn)行TALE識(shí)別模塊的構(gòu)建。通過DNA識(shí)別域結(jié)合到靶位點(diǎn)上，以及FokI的切割域形成二聚體后，可特異性對目標(biāo)基因DNA實(shí)現(xiàn)切斷。在非同源末端連接修復(fù)過程中，DNA雙鏈斷開后會(huì)由于堿基的隨機(jī)增減造成目標(biāo)基因功能缺失。該技術(shù)目前已成功應(yīng)用于植物、細(xì)胞、酵母、斑馬魚及大、小鼠等各類模式動(dòng)物的研究領(lǐng)域。

二、服務(wù)流程

1、設(shè)計(jì)、構(gòu)建TALEN質(zhì)粒

2、TALEN質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄成mRNA

3、mRNA原核顯微注射（F0小鼠生產(chǎn)）

4、F1小鼠生產(chǎn)

三、技術(shù)特點(diǎn)

1、無基因序列、細(xì)胞、物種限制，可敲除大部分基因。

2、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單準(zhǔn)確、實(shí)驗(yàn)周期短、成本低。

3、毒性低、脫靶情況少；成功率高。

4、TAL的核酸識(shí)別單元與A、G、C、T有恒定的對應(yīng)關(guān)系。

5、可識(shí)別給到的目標(biāo)基因序列，且不受上下游序列影響。