pH對發(fā)酵的影響及調(diào)控

微生物發(fā)酵是一個十分復雜的生物化學反應過程，由于生物體的生長、繁殖、代謝有許多不確定性，并受環(huán)境影響比較大，而微生物細胞內(nèi)同時進行著成千上萬種不同的生化反應，各有各的調(diào)控機制，相互促進相互制約，因此，其控制過程也比較難，只能依據(jù)宏觀現(xiàn)象或借助一些檢測手段來推測微觀變化，而后施行進行人為干預，進而引導其朝著我們設定的方向發(fā)展。

與微生物發(fā)酵相關的參數(shù)包括：物理、化學、生物三類。

1、物理參數(shù)包括：溫度、罐壓、攪拌轉速、攪拌功率、空氣流量、發(fā)酵液粘度；

2、化學參數(shù)包括：酸堿度、基質濃度、溶解氧濃度、氧化還原電位、中間體物質濃度、產(chǎn)物濃度、比生產(chǎn)速率、尾氣氧含量、尾氣二氧化碳含量；

3、生物參數(shù)包括：菌體濃度、比生長速率、菌體形態(tài)。

*部分 現(xiàn)行的pH控制理論

*節(jié) 為什么要控制pH值

1. 影響菌體生長：

每種微生物都有其適合生長的pH值范圍，原因有二：

（1） 對營養(yǎng)成分的影響：不同的pH值條件下，培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質的穩(wěn)定性不同；各營養(yǎng)物質之間發(fā)生化學反應不同；有機碳、氮源的水解或變性不同。進而影響菌體對營養(yǎng)物質的利用。

（2） 對菌體生物酶活性影響： 培養(yǎng)基中的H⁺或OH^-直接影響胞外生物酶的活性，進而影響菌體生長。

（3） 對菌體細胞結構的影響。

（4） 對菌體細胞膜荷電影響：引起細胞膜的通透性發(fā)生改變，因而影響菌體對營養(yǎng)物質的吸收和代謝物排泄。

2. 影響菌體代謝：

培養(yǎng)基中的H⁺、OH^-首先作用在胞外的弱酸（或弱堿）上，使之成為易于透過細胞膜的分子狀態(tài)的弱酸（弱堿），它們進入細胞后，再進行解離，產(chǎn)生H⁺或OH^-離子，改變胞內(nèi)原先的中性狀態(tài)，影響酶的結構和活性。進而影響菌體代謝。

3. 影響產(chǎn)物穩(wěn)定性：

不同的物質有不同的穩(wěn)定pH值范圍。特別是胞外表達的產(chǎn)物，直接裸露于培養(yǎng)液中，給予合適的pH條件至關重要。

4. 影響發(fā)酵液的后處理：

（1） pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質的電荷性質

（2） pH值會影響發(fā)酵液的粘度。

第二節(jié) 是什么原因使pH值產(chǎn)生變化

1. 培養(yǎng)基基質：

（1） 成分種類、含量及配比，分兩種情況：

其一，成分本身的酸堿特性；

其二，成分經(jīng)過菌體代謝后呈現(xiàn)出酸堿性：凡是代謝后產(chǎn)生酸性的物質，稱為生理酸性物質；經(jīng)代謝后產(chǎn)生堿性的物質，稱為生理堿性物質。

生理酸性物質，如硫酸銨：菌體吸收其中的NH4作為氮源，殘留的SO4與培養(yǎng)液中的H+結合成硫酸而使pH值降低。

生理堿性物質，如硝酸鈉：菌體吸收其中的NO3-量遠大于對Na 的吸收量，為保持體內(nèi)電性平衡，細胞向外界分泌HCO3-或OH-，使溶液的pH值上升。

（2） 培養(yǎng)基滅菌：培養(yǎng)基中基質成分在高溫高壓狀態(tài)下發(fā)生變化引起pH改變。

2、 菌體生長不同階段對pH影響不同：

（1） 菌體指數(shù)生長期：本階段pH值迅速降低。

原因如下：

為滿足菌體快速生長，大量營養(yǎng)物質被利用，打破原有體系的pH值體系平衡。

如：碳源代謝：無論是單糖、雙糖、寡糖還是多糖，均先經(jīng)水解為單糖再被利用，利用后產(chǎn)生有機酸，使pH值降低。

（2） 菌體生長平臺期：菌體生長、衰亡趨于平衡。pH值基本呈下降，但趨勢趨緩。若此時pH快速回升，說明碳源被利用完，菌體被迫利用胞內(nèi)有機酸所致。

（3） 菌體衰亡期：由于菌體衰亡、自溶，pH值迅速回升。

注：若在菌體平臺期、衰亡期出現(xiàn)pH值迅速下降狀況，原因可能如下：

1） 傳感器故障；

2） 染菌；

3） 補料時間過早，前期營養(yǎng)物質剩余；

4） 補料速率不合理，造成二次生長。

3、通氣量及罐壓

（1）通氣量不足：

1）引起pH降低：厭氧發(fā)酵，產(chǎn)生大量乳酸pH值降低；另外，通氣量流量小，產(chǎn)生的CO2不能及時隨尾氣排出，CO2溶于水中，使pH值降低；

2）引起pH值升高：氧氣供應不足使菌體衰亡自溶，引起pH值升高。

（2）罐壓太高：一般高于0.03Mpa

引起pH值降低：隨著壓力增高，CO2在水中溶解度增加，因此引起pH值降低。

*節(jié) 發(fā)酵過程中pH值控制手段

1、 改變培養(yǎng)基中基質成分及比例：

每種微生物生長，以及目的產(chǎn)物的合成對營養(yǎng)物質的需求有一定的偏好性，因此可以利用來調(diào)控的空間不大。

2、 培養(yǎng)基中增加緩沖體系：

但需關注緩沖體系成分對菌體生長代謝的影響。

3、 培養(yǎng)過程中通過補加碳源來調(diào)節(jié)pH值

4、培養(yǎng)過程中使用酸、堿進行調(diào)控：

常用酸如：鹽酸、硫酸、醋酸、硝酸等；常用堿如：氫氧化鈉、氨水等。

注意：

（1）氨水可被作為氮源利用，因而打破營養(yǎng)物質的碳氮比平衡。

（2）酸、堿調(diào)解過程，會造成培養(yǎng)液的局部過酸或過堿，從而引起局部菌體被灼傷、或代謝物被強酸、強堿破壞。

（3）酸、堿調(diào)控，會改變培養(yǎng)液的離子強度。

第二部分 本人經(jīng)驗分享

*節(jié) 發(fā)酵過程中pH值變化的本質

1、 pH變化的關鍵原因：除培養(yǎng)基基質成分、通氣量和壓力等理、化因素影響外，更多的是菌體生長代謝過程的生物因素。

2、 pH值檢測方法：在線的pH電極即時測定；取樣離線的pH計、pH試紙測定等。

3、 pH值變化的本質：

由pH值測定方法可以看出，無論何種方法的測定值均代表的是菌體生物過程的結果，也就是說pH值測定永遠滯后于菌體的生物過程。因此，pH值是菌體生物過程的結果。

第二節(jié) 基于pH值是生物過程的結果理論而形成的發(fā)酵過程中pH值控制原則和方法

既然pH值是生物過程的結果，那么一個發(fā)酵周期內(nèi)菌體能夠自然的達到理想的菌體生

長代謝所需的pH值才是“本”；而基于即時測定值而此進行的任何調(diào)控均是事后之事，謂之為“末”并不為過。常規(guī)的pH調(diào)控手段，往往掩蓋了菌體生長、代謝的真實狀態(tài)。因而為了控制pH值而控制pH即為“舍本逐末”。

1、pH值的調(diào)控原則：

（1）以前饋作為調(diào)控節(jié)點；

（2）以順勢引導菌體生產(chǎn)、代謝過程為調(diào)控依據(jù)；

（3）以測定的pH值作為對調(diào)控手段有效性的檢驗。

2、pH值的調(diào)控方法：把握前饋節(jié)點，控制菌體生長速度的方式，使發(fā)酵過程pH值在理想范圍內(nèi)。

（1）基礎培養(yǎng)基配方：盡量避免緩沖體系；低濃度的碳、氮源，一般含量不超過1%；避免碳、氮源比例失衡（不同種類微生物、不同的代謝產(chǎn)物 所需碳氮比不同）；

（2）補料培養(yǎng)基配方及補料速率：分三個階段

*階段：指數(shù)生長期。

1） 補料配方：碳氮比宜高，且以*碳、氮源為主；

2） 補料速率：控制比生長速率在30%左右，即可控制pH平緩下降。

生長速率太低生物量積累太少不利于產(chǎn)物表達。生長速率過高，菌體迅速進入衰亡期，pH值變化幅度過大、生產(chǎn)周期短，進而不利于產(chǎn)物積累。

3） 補料節(jié)點：以pH值比變化速率降低為補料節(jié)點（前饋點），可以有效的控制pH值變化，且不會造成營養(yǎng)過剩、或營養(yǎng)匱乏。

第二階段：平臺期（初級代謝產(chǎn)物開始積累）。

1） 補料配方：碳氮比縮小，增加遲效碳、氮源。

2） 補料速率：控制生物量基本保持不變，即可控制pH平穩(wěn)。

3） 補料節(jié)點：以pH值比變化速率降低為補料節(jié)點（前饋點）。

第三階段：衰亡期（次級代謝產(chǎn)物大量積累）

1） 補料配方：碳、氮源濃度僅維持菌體代謝即可。

若過高則造成菌體二次生長，使pH值下降。

2） 補料節(jié)點：以pH值比變化速率降低（緩慢回升過程）為補料節(jié)點，可維持pH值平穩(wěn)。

總結：

發(fā)酵過程中的pH值變化是發(fā)酵過程狀態(tài)體現(xiàn)、是生物生長代謝的結果。pH值不是發(fā)酵過程中需要控制的參數(shù)，而是發(fā)酵過程控制的依據(jù)和方向標。