組織SPHK1激酶活性光譜法定量檢測試劑盒

組織SPHK1激酶活性光譜法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

組織SPHK1激酶活性光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過底物D-蘇式-鞘胺醇C-18，在SPHK1激酶敏感性抑制劑存在與否的情況下，受到SPHK1磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測定其氧化后吸光峰值的變化，以分析組織裂解樣品中SPHK1活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中SPHK1激酶特異活性的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

鞘胺醇激酶（Sphingosine kinase；SPHK1；EC2.7.11.13），屬于脂類激酶（lipid kinase）類，包括神經(jīng)鞘氨醇激酶（ceremide kinase）、二酰甘油激酶（diacylglycerol kinase；DAGK）和磷酸肌醇3激酶（Phosphoinositide 3-kinase；PI3K）等，在原生動物、酵母、植物、哺乳動物等具有進(jìn)化保留，其中哺乳動物有2個(gè)同工酶：SPHK1和SPHK2，SPHK1分子量小，但活性高。SPHK1主要在肺、肝、脾臟等高度表達(dá)，而SPHK2主要在肝臟和心臟高度表達(dá)。SPHK主要在胞漿里，通過磷酸化鞘胺醇（Sphingosine），產(chǎn)生鞘氨醇-1-磷酸（Sphingosine-1-phosphate；S-1-P），一種具有強(qiáng)力生物活性的鞘脂類分子（sphingolipids），成為細(xì)胞繁殖、分化、運(yùn)動、存活、免疫細(xì)胞活化、鈣離子信號通路、細(xì)胞骨架重構(gòu)、發(fā)育形態(tài)變化等重要的調(diào)節(jié)性信使分子。由此成為抗炎、抗癌和其它病理?xiàng)l件治療的重要藥物靶標(biāo)。基于底物D-蘇式-鞘胺醇C-18（D-erythro-Sphingosine C-18），在SPHK1激酶敏感性抑制劑SKI5C（2,2-dimethyl-4S-（1-oxo-2-hexadecyn-1-yl）-1,1-dimethylethyl ester-3-oxazolidine carboxylic acid）存在與否的情況下，受到SPHK1激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物鞘氨醇-1-磷酸（Sphingosine-1-phosphate；S-1-P）和ADP，進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析鞘胺醇激酶1的特異活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

SPHK1激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品預(yù)處理

比色皿或96孔板：用于光譜分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光譜分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 待測樣品準(zhǔn)備

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗
• （選擇步驟）抽去清理液
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過一夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B） 
• 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆茫?/span>
• 即刻放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測
• 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

• 測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測樣品（例如組織裂解懸液等），置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘 

• 樣品總活性測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入5微升待測樣品（注意：50微克組織裂解蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘 

• 樣品非特異活性測定

檢測開始前，移取xx微升緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升專性液（Reagent H）和待測樣品（注意：50微克組織裂解蛋白），混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F） 
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測樣品
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘

• 計(jì)算樣品活性

• 樣品總活性和非特異活性計(jì)算

2）樣品特異活性計(jì)算

七、酶標(biāo)儀測定

1）樣品總活性測定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克組織裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

• 樣品非特異活性測定

檢測開始前，移取xx微升緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升專性液（Reagent H）和待測樣品（注意：50微克組織裂解蛋白），混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測樣品
• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測樣品
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

• 樣品特異活性計(jì)算

八、抑制劑篩選

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、*活性和待測抑制劑樣品
• 按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理

• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
• 分別加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測樣品
• 即刻放進(jìn)30℃酶標(biāo)儀檢測：測讀30分鐘
• 抑制活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 如果出現(xiàn)明顯的干擾現(xiàn)象，建議使用樣本背景對照去除任何內(nèi)源性干擾因子
• 加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測定
• 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)30分鐘
• 光譜測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用SPHK1抑制劑作為抑制劑對照或陰性對照
• 鞘胺醇激酶1活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感