組織血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶總活性比色法定量檢測(cè)試劑盒

組織血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶總活性比色法定量檢測(cè)試劑盒
說(shuō)明書
主要用途
組織血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶（ACE）總活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)三肽化合物底
物FAPGG 受到血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶的水解，釋放出FAP，產(chǎn)生吸收峰值的變化，即采用比
色法來(lái)測(cè)定組織裂解萃取樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精
心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲等）
血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶（ACE）的總活性檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，
即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，具有高通量、自動(dòng)化操作的優(yōu)點(diǎn)。
技術(shù)背景
血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶（angiotensin I-converting enzyme；ACE；EC3.4.15.1），又稱為肽基二
肽酶A（peptidyl dipeptidase A）、羧基組織蛋白酶（carboxycathepsin）或激肽酶II（kininase
II），是一種體細(xì)胞類150 至180KD、生殖細(xì)胞類90 至110KD 的多肽外切酶（exopeptidase）
和鋅金屬肽酶（zinc metallopeptidase）。血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶有2 種同工酶：1 型和2 型，其
間80 至90%同源。I 型主要存在于肺毛細(xì)管細(xì)胞內(nèi)，也在血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞和睪
丸leydig 細(xì)胞膜中表達(dá)；II 型主要存在于心臟和腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上。ACE 在腎素-血管
緊張素-醛固酮（aldosterone）系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。作為血管收縮劑（vasoconstrictor），ACE
催化十肽血管緊張素I 的C 末端的組胺酰亮氨酸（histidylleucine）二肽的切離水解反應(yīng)，轉(zhuǎn)
化為血管緊張素II；同時(shí)作為血管擴(kuò)張劑（vasodilator），ACE 使緩激肽（bradykinin）失活。
ACE 常用于藥物靶標(biāo)，治療高血壓（例如噻嗪化物thiazide）、心力衰竭（例如利尿靈
furosemide）、糖尿病腎有關(guān)病和SARS 等疾患。基于人工合成的三肽化合物底物呋喃基丙烯酰苯
丙氨酰甘氨酰甘氨酸（N-[3-(2-furyl)acryloyl]-L-phenylalanylglycylglycine；FAPGG）受到血
管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶的水解，釋放出呋喃基丙烯酰苯丙氨酸（furylacryloylphenylalanine；FAP）
和雙甘氨肽（glycylglycine），產(chǎn)生吸收峰值的變化，在分光光度儀（340nm 波長(zhǎng)）下，來(lái)
定量測(cè)定血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶的總活性。血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
陰性液（Reagent D） 毫升
底物液（Reagent E） 毫升
說(shuō)明書1 份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；底物液（Reagent E）
避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6 月
用戶自備
15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
1.5 毫升離心管：用于樣品制備和儲(chǔ)存的容器
超速離心管：用于樣品離心的容器
臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀
4℃超速離心機(jī)：用于分離膜蛋白成分
DOUNCE 勻漿器：用于裂解組織細(xì)胞
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育
酶標(biāo)板或比色皿：用于樣品比色測(cè)定的容器
酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、樣品制備
1. 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500 毫克組織重量
2. （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15 毫升錐形離心管
3. （選擇步驟）加入毫升清理液（Reagent A）清洗1 次
4. 移入到一個(gè)液氮凍存管
5. 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)一夜
6. 次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組
織凍融）
7. 放進(jìn)一個(gè)15 毫升錐形離心管
8. 加入預(yù)冷的微升裂解液（Reagent B）
9. 渦旋震蕩5 秒，充分混勻
10. 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE 勻漿器
11. 在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80 下）
12. 將所有組織勻漿物移入15 毫升錐形離心管
13. 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘，速度為1500g
14. 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的超速離心管
15. 加入微升裂解液（Reagent B），混勻沉淀顆粒——此步驟獲得粗提總蛋白
16. （選擇步驟）放進(jìn)上述超速離心管到4℃超速離心機(jī)離心30 分鐘，速度為40000g
17. （選擇步驟）小心移出上清液到到預(yù)冷的1.5 毫升離心管——此步驟獲得膜蛋白
18. 移取10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)
19. 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測(cè)定準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好藥物處理的待測(cè)樣品
2． 設(shè)定好酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)340nm，間隔5 分鐘，讀數(shù)6 次（共30 分鐘），并
置零或0 分鐘和30 分鐘各測(cè)讀1 次，并置零
3． 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避
免光照
三、活性測(cè)定
1． 在96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
2． 分別移取微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔中
3． 分別加入20 微升陰性液（Reagent D）或上述制備的待測(cè)樣品（100 微克蛋白）到相應(yīng)
孔中（注意：樣品須清澈）
4． 分別加入微升底物液（Reagent E）
5． 輕輕搖動(dòng)96 孔酶標(biāo)板（限定在10 秒之內(nèi)）
6． 即刻放進(jìn)37℃預(yù)熱的酶標(biāo)儀檢測(cè)或轉(zhuǎn)移到200 微升比色皿，在分光光度儀里檢測(cè)
7． 獲得吸光讀數(shù)：0 分鐘讀數(shù)－30 分鐘讀數(shù)
8． 活性計(jì)算：
（1） 酶標(biāo)儀檢測(cè)
單位＝微摩爾FAP/分鐘
（2） 比色皿檢測(cè)
單位＝微摩爾FAP/分鐘
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20 次操作，包括背景對(duì)照
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1 次
4． 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融
5． 樣品避免使用EDTA 和EGTA 等處理
6． 加樣后10 秒內(nèi)比色測(cè)定
7． 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定持續(xù)30 分鐘
8． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
9． 樣品0 分鐘讀數(shù)通常和背景空對(duì)照0 分鐘讀數(shù)一致
10．樣本測(cè)定30 分鐘讀數(shù)低于0 分鐘讀數(shù)，即讀數(shù)下降，表明具有酶活性
11．建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100 微克/20 微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加
或降低樣本量(我司提供Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
12．如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
13．可以使用血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利（captopril；IC50=10 納摩爾）作為抑制
劑對(duì)照或陰性對(duì)照
14．血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶單位活性定義為：在37℃，pH 8.3 條件下，每分鐘內(nèi)能夠產(chǎn)生1
微摩爾呋喃基丙烯酰苯丙氨酸（Furylacryloylphenylalanine）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
15．本公司提供系列血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感