動(dòng)物細(xì)胞鈉/鉀ATP檢測(cè)試劑盒

動(dòng)物細(xì)胞鈉/鉀ATP檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
主要用途
動(dòng)物細(xì)胞鈉/鉀ATP酶（Na＋/K＋ -ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用鈉/鉀ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，在特異性抑制劑存在與否的情況下，受到鈉鉀ATP酶的水解產(chǎn)生的ADP過(guò)程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測(cè)定其氧化后吸光峰值（NADH濃度）的變化，以此進(jìn)行測(cè)算單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種動(dòng)物細(xì)胞裂解懸液Na＋/K＋-ATP酶的特異性活性檢測(cè)。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。
技術(shù)背景
鈉/鉀ATP酶（Na＋/K＋-ATPase；EC3.6.1.3），是五類ATP酶（F、V、A、P和E型）中P型ATP酶（P type ATPase）之一。ATP酶催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無(wú)機(jī)磷。這一去磷酸化反應(yīng)釋放出能量，成為細(xì)胞生命代謝的能源。ATP酶為跨膜蛋白（transmembrane），幫助傳輸各種代謝分子進(jìn)出細(xì)胞。P型ATP酶，又稱為E1-E2 ATP酶，通常由一條或兩條多肽構(gòu)成，且呈現(xiàn)兩種主要的結(jié)構(gòu)構(gòu)象E1和E2。這類ATP酶存在于細(xì)菌和真核細(xì)胞膜和細(xì)胞器上，其功能在于水解ATP獲得能量，跨膜運(yùn)輸各種化學(xué)分子，包括離子和磷脂，例如H+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ag+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Ni2+、Cd2+、Cu2+等。P型ATP酶可以分成4種，Ca2+傳輸性、Na+-K+ /H+-K+傳輸性、H+傳輸性和所有細(xì)菌型等。鈉/鉀ATP酶，又稱為鈉鉀泵（Na+-K+ pump），是一種電致（electrogenic）膜蛋白。細(xì)胞排鈉吸鉀時(shí)，細(xì)胞膜兩邊無(wú)電荷流動(dòng)，并建立細(xì)胞內(nèi)外離子（胞內(nèi)低鈉、胞外高鉀）濃度平衡，維持細(xì)胞靜態(tài)膜電位，控制細(xì)胞容量。鈉/鉀ATP酶是心臟病的重要藥物靶標(biāo)。基于ATP，在鈉/鉀ATP酶抑制劑烏本苷（ouabain）存在與否的情況下，受到鈉鉀ATP酶的水解，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析鈉/鉀ATP酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
Na＋/K＋-ATPase
ATP + H2O → ADP + Pi
ouabain
pyruvate kinase
Phosphoenolpyruvate + ADP → pyruvate + ATP
lactate dehydrogenase
pyruvate + NADH → lactate + NAD+
（高吸收峰） （低吸收峰）
產(chǎn)品內(nèi)容 1
酶 活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
酶促液（Reagent D） 微升
反應(yīng)液（Reagent E） 毫升
底物液（Reagent F） 毫升
陰性液（Reagent G） 毫升
專性液（Reagent H） 毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月
用戶自備
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器
細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
比色皿：用于光譜分析的容器
分光光度儀：用于光譜分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；緩沖液（Reagent C）室溫預(yù)熱；底物液（Reagent F）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。
一、 樣品準(zhǔn)備（總蛋白制備）
1． 準(zhǔn)備好25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 106細(xì)胞）
2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞
5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻
10．轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
11．強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
12．置于冰槽里孵育30分鐘 2
13．放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
15．移取10
16．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測(cè)定準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞總蛋白或膜蛋白等），置于冰槽里
2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)7次（共30分鐘），并置零
三、 背景對(duì)照測(cè)定
1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
4． 加入xx微升底物液（Reagent F）
5． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6． 加入xx微升陰性液（Reagent G）
7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)30分鐘
四、 樣品總活性測(cè)定
1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
4． 加入xx微升底物液（Reagent F）
5． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6． 加入50微升待測(cè)樣品（注意：50微克膜蛋白；樣品須溶解）
7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)30分鐘
五、樣品非特異活性測(cè)定
1. 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入xx微升酶促液（Reagent D）
3. 加入xx微升專性液（Reagent H）
4. 加入xx微升底物液（Reagent F）
5. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6. 加入50微升待測(cè)樣品（注意：50微克膜蛋白；樣品須溶解）
7. 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)30分鐘
六、 計(jì)算樣品活性 3
微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)
1）樣品活性（總活性和非特異活性）
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 10或30（反應(yīng)時(shí)間，分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
或者
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05（樣品重量；毫克）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 10或 30（反應(yīng)時(shí)間，分鐘）]＝單位/毫克
單位＝微摩爾NADH/分鐘
2）樣品特異活性
樣品總活性測(cè)定－樣品非特異活性測(cè)定＝樣品特異活性
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為21次操作（10個(gè)樣本），包括背景對(duì)照測(cè)定
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
4． 建議樣品忌用磷酸緩沖溶液、鈣鹽、鎂鹽等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等
5． 建議使用細(xì)胞膜蛋白（本公司提供細(xì)胞可溶性膜蛋白（粗提）制備試劑盒）
6． 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測(cè)定
7． 如果測(cè)定初期，背景對(duì)照吸光讀數(shù)不穩(wěn)定，表明體系均衡溫度不理想，建議樣品加入前孵育由3分鐘延長(zhǎng)至5分鐘
8． 反應(yīng)測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可以持續(xù)30分鐘
9． 測(cè)定值由高到低變化，即0分鐘測(cè)定讀數(shù)高于10分鐘或30分鐘測(cè)定讀數(shù)，表明有酶活性
10．光譜測(cè)定后，比色皿須清洗*
11．建議待測(cè)樣本膜蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣本量；注意計(jì)算公式的調(diào)整（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
12．樣品特異活性是指烏本苷敏感的鈉/鉀ATP酶
13．鈉/鉀ATP酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
14．本公司提供系列ATP酶類分析技術(shù)產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確
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