免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)步驟

免疫組化步驟（ABC法）

1。4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中過夜。蠟塊制作。切片，貼片。0.01MKPBS清洗5min×3后； 

2。加入配好的0.3%的過氧化氫甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%過氧化氫）30min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響，0.01MPBS清洗5min×3； 

3。加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MKPBS 100ml）30min，以增加細(xì)胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3； 

4。加入用血清稀釋液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋疊氮納0.08g）稀釋的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗體，0.01MKPBS洗5min×3； 

5。加入0.01MKPBS稀釋的的二抗，室溫孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3； 

6。加入ABC復(fù)合物之類的抗體，室溫孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸餾水迅速沖三次； 

7。加入顯色液，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，時間一般不超過30min，可不時在顯微鏡下進(jìn)行觀察，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速沖三次后加入0.01MKPBS終止反應(yīng)； 

8。梯度酒精脫水之后，封片，拍照。 

免疫組化SP法步驟：

SP(streptavidin-perosidase)法,即鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法.

按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標(biāo)法和免疫金銀法等。按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步、三步或多步法)；按結(jié)合方式可分為抗原—抗體結(jié)合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法和親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法等，其中SP法是zui常使用的方法。 

一般的sp法步驟啊,具體如下：

1.烤片，68℃，20分鐘,

2. 常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I(xiàn) 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min 

3.阻斷 滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS沖洗3X5min；

4. 抗原修復(fù):置0.01M枸櫞酸緩沖液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷卻20min 以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3X5min。

5. 正常羊血清工作液封閉，37℃10 min，傾去勿洗.

6. 滴加一抗4℃ 冰箱孵育過夜，PBS沖洗3X5min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）；

滴加生物素標(biāo)記二抗, 37℃孵育30min, PBS沖洗3X5min;

7. 滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30min, PBS沖洗3X5min;

8. DAB/ H2O2反應(yīng)染色，自來水充分沖洗后，

蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。

免疫組化（Elivision二步法）：

（1）石蠟切片置于67℃烘箱中，烘片2小時，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。

（2）取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2×3’。(注：不是所有的抗體都需要微波修復(fù)的，視具體情況而定)

（3）每張切片加1滴3% H2O2，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3×3’。

（4）除去PBS液，每張切片加1滴相應(yīng)的*抗體（相應(yīng)稀釋倍數(shù)），室溫下孵育2小時。

（5）PBS沖洗3×5’。除去PBS液，每張切片加1滴聚合物增強(qiáng)劑（試劑A），室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3×3’。

（6）除去PBS液，每張切片加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物（試劑B），室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3×5’

（7）除去PBS液，每張切片加1滴新鮮配制的DAB液，顯微鏡下觀察5分鐘。

（8）蘇木素復(fù)染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察。

注：即用型第二代免疫組化Elivision plus廣譜試劑盒，購自福州脈新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。包括：生物素化抗兔二抗、親和素（Reagent A）、生物素－辣根過氧化物酶（Reagent B）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）