RNA 甲基化修飾（m6A）研究技術(shù)及方案設(shè)計(jì)

RNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)內(nèi)容的重要內(nèi)容之一， 其中 m6A（N6-methyladenosine，6- 甲基腺嘌呤，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖 1）較為常見的一種修飾方式。m6A 是一種動(dòng)態(tài)可逆的修飾方式，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用，其在調(diào)控基因表達(dá)、剪接、RNA 編輯、RNA 穩(wěn)定性、控制 mRNA 壽命和降解、介導(dǎo)環(huán)狀 RNA 翻譯 [1] 等方面扮演重要角色，具有重要的研究意義（見圖 2）。

圖 1.6- 甲基腺嘌呤化學(xué)結(jié)構(gòu)及可逆反應(yīng)過程

圖 2. 動(dòng)態(tài)修改的 m6A 修飾及介導(dǎo)的生物學(xué)功能 [2]

M6A 甲基化修飾是由一個(gè)多蛋白復(fù)合物介導(dǎo)產(chǎn)生，目前已知這個(gè)復(fù)合物的成分包括 METTL3，METTL14 和 WTAP；而負(fù)責(zé)擦除甲基化修飾基團(tuán)的則由去甲基化酶 FTO 和 ALKBH5 所承擔(dān)。在細(xì)胞核中的 HNRNPC 負(fù)責(zé)識(shí)別 m6A 修飾基團(tuán)，并介導(dǎo) mRNA 前體的選擇性剪接。而另外一個(gè) m6A 識(shí)別蛋白 HNRNPA2B1[3] 則促進(jìn) pri-miRNA 加工成 pre-miRNA。在細(xì)胞質(zhì)中，不同的 M6A 位點(diǎn)識(shí)別蛋白介導(dǎo)不同的功能。YTHDF1 和 YTHDF3[4,5] 識(shí)別 m6A 修飾 mRNA，通過與起始因子及核糖體相互作用促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯，eIF3 識(shí)別蛋白也會(huì)直接綁定到 mRNA5’UTR 端的 m6A 位點(diǎn)參與翻譯起始。而另外一個(gè)識(shí)別蛋白 YTHDF2 與 m6A 識(shí)別將導(dǎo)致 mRNA 的降解。目前還存在其他未知的 m6A 識(shí)別蛋白，相關(guān)研究的繼續(xù)開展將有利于解開 m6A 在 mRNA 運(yùn)輸、翻譯和存儲(chǔ)等功能的謎團(tuán)。

雖然 RNA 甲基化的研究在上世紀(jì)七十年代就開始，但是由于技術(shù)上的局限一直停滯不前，直到zui近幾年在何川教授等團(tuán)隊(duì)的帶領(lǐng)下，通過不斷的技術(shù)創(chuàng)新和難點(diǎn)攻克，m6A 等甲基化修飾的研究才不斷取得突破性的研究成果。

關(guān)于 m6A 的研究方向，主要涉及 m6A 本身的修飾過程涉及的甲基化酶和去甲基化酶，以及 m6A 識(shí)別蛋白。這個(gè)研究方向的研究技術(shù)難度較大，涉及較多生化實(shí)驗(yàn)。其次是 m6A 修飾譜構(gòu)建及作用機(jī)制，特別是構(gòu)建疾病細(xì)胞模型或者發(fā)病組織的 m6A 修飾譜，涉及較為關(guān)鍵的 MeRIP-seq (methylated RNA immunoprecipitation sequencing) 高通量測(cè)序技術(shù) [6]。第三個(gè)方向是 m6A 修飾失衡介導(dǎo)相關(guān)基因異常（可變剪切、穩(wěn)定性、翻譯、miRNA 調(diào)控）在所發(fā)揮的作用。第四個(gè)方向是通過大數(shù)據(jù)分析，利用公共數(shù)據(jù)資源對(duì) m6A 修飾涉及的基因進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行共表達(dá)分析預(yù)測(cè)其可能調(diào)控的靶基因，進(jìn)而進(jìn)行功能驗(yàn)證。（見圖 3）

圖 3. m6A 的主要研究方向

下面我們將重點(diǎn)介紹其中一種研究方向的設(shè)計(jì)思路，并提供相應(yīng)的技術(shù)服務(wù)和解決方案。

研究方向：構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組 m6A 修飾圖譜

研究目的：構(gòu)建目標(biāo)樣本的 m6A 修飾譜，揭示在特定生命過程或者疾病模型中的 m6A 圖譜。

實(shí)驗(yàn)樣本：細(xì)胞、組織、提取后的總 RNA（限定有參基因組物種）

關(guān)鍵技術(shù)：meRIP-seq (methylated RNA immunoprecipitation sequencing)，也稱 m6A-seq

zui近幾年來 m6A 研究迅速發(fā)展，正是得益于 meRIP-seq 技術(shù)的開發(fā)及應(yīng)用。meRIP-seq 高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，能夠檢測(cè)全轉(zhuǎn)錄組不同的 RNA 甲基化，是成功發(fā)現(xiàn) RNA 甲基化機(jī)理及功能的關(guān)鍵技術(shù)。

MeRIP-seq 技術(shù)將甲基化 DNA 免疫共沉淀 (methylated DNA immunoprecipitation， MeDIP) 技術(shù)、RNA 結(jié)合蛋白免疫共沉淀 (RNA immunoprecipitation，RIP) 技術(shù)和 RNA 測(cè)序 (RNA sequencing，RNA-seq) 技術(shù)組合起來，高精度地檢測(cè)全基因組 (或全轉(zhuǎn)錄組) 范圍內(nèi)的 RNA 甲基化。MeRIP-seq 技術(shù)采用免疫共沉淀方法，即甲基化 RNA 特異性抗體與被隨機(jī)打斷的 RNA 片段進(jìn)行孵育，抓取有甲基化修飾的片段進(jìn)行測(cè)序；同時(shí)需要平行測(cè)序一個(gè)對(duì)照 (control) 樣本，對(duì)照樣本用于消除抓取帶有甲基化片段過程中的背景。然后將免疫共沉淀 (IP) 樣本和對(duì)照樣本中的序列片段對(duì)比 (或定位) 到參考基因組 / 轉(zhuǎn)錄組上，檢測(cè) RNA 甲基化位點(diǎn)。對(duì)照樣本測(cè)量對(duì)應(yīng) RNA 的表達(dá)量，本質(zhì)上是 RNA-seq 數(shù)據(jù) (圖 4)[7]。

圖 4 .MeRIP-seq 技術(shù)檢測(cè) m6A 技術(shù)流程 [4]

實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置：

細(xì)胞模型 實(shí)驗(yàn)組 VS 對(duì)照組，建議 3:3

組織模型 正常組 VS 疾病組，建議 5:5

組內(nèi)對(duì)照：IP 組 VS in put 組 *

注 *：input 組主要用于比較鑒定 IP 組的抗體特異性結(jié)合，是*的組分

測(cè)序模式：PE100/150

測(cè)序數(shù)據(jù)：3-6G

關(guān)鍵分析內(nèi)容：m6A 的基本特征

m6A 修飾基本特征分析主要包括以下三個(gè)方面

特征一、peak 在基因元件的分布

本分析主要通過對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)后，分析相關(guān)序列在基因不同原件的分布。主要方法是將 5-UTR，CDS，3-UTR 各劃分為等長(zhǎng)的 20 個(gè) bin，統(tǒng)計(jì) peak 落在每個(gè) bin 中 peak 的百分比。Peak 和 bin 的 overlap 長(zhǎng)度占 50% 以上就算落在了這個(gè) bin 上?；蛟植紙D見圖 5、圖 6：

圖 5 Peak 在元件中的分布曲線圖。綠色表示 CDS，藍(lán)色表示 UTR，灰色的細(xì)線表示 start-coden 的起始位點(diǎn)和 stop-coden 的終止位點(diǎn)

圖 6 Peak 分布條形圖 ， 橫坐標(biāo)表示各元件，縱坐標(biāo)表示落在元件中的 peak 百分比

特征二、 reads 在基因元件的分布

找到富集區(qū)域（peak）后，統(tǒng)計(jì) reads 在元件中的分布情況。針對(duì) peak，分別提取 IP 和 Input 在 peak 區(qū)間的 reads，reads 和 peak overlap 上 50% 以上就算 reads 落在 peak 區(qū)間 , 同時(shí) normalized IP 和 Input 的數(shù)據(jù)量比例。(如圖 7)

圖 7 reads 在元件中的分布曲線圖。綠色表示 CDS，藍(lán)色表示 UTR，，縱坐標(biāo)表示 normalized 后的覆蓋深度

特征三、Peak 關(guān)聯(lián)基因的特征

針對(duì) Peak 關(guān)聯(lián)上的基因 ， 看它的 stop-coden、start-coden 是否有 m6A 富集區(qū)域 （peak）， 以此將 gene 分為 4 類：PeakStart (m6A peaks around start codon), PeakStop (m6A peaks around stop codon), PeakBoth (m6A peaks around both start and stop codons) and others。

圖 8 peak 關(guān)聯(lián)基因特征 pie 圖

兩樣品 peak overlap 占 50% 以上則定義為 common peak， 其他的定義為 special peak。共有和* peak 的韋恩圖如下 (見圖 9)：

圖 9 兩樣本 peak 韋恩圖

通過 以上的 m6A 特征分析，后續(xù)的重要分析還包括針對(duì)差異 peak 來分析關(guān)聯(lián)的基因，以及對(duì)這些基因進(jìn)行 GO 和 KEGG 分析。其次，還可以針對(duì)目前的研究熱點(diǎn)，對(duì) peak 進(jìn)行 circRNA 分析，有利于指導(dǎo)環(huán)狀 RNA 翻譯功能的研究工作 [1]。

另外，通過和同組樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，可以進(jìn)一步深挖 m6A 修飾對(duì)可變剪切、RNA 編輯、RNA 表達(dá)豐度、miRNA 加工生成等方面的影響；也可以結(jié)合蛋白質(zhì)譜定量檢測(cè)，研究 m6A 修飾與蛋白質(zhì)翻譯的關(guān)系，指導(dǎo)進(jìn)一步的深入功能機(jī)制研究。

自 2011 年何川教授發(fā)表 FTO 作為 m6A 去甲基化酶 [8] 的研究工作以來，m6A 的研究深度和廣大快速發(fā)展。為了幫助國(guó)內(nèi)生物醫(yī)學(xué)特別是腫瘤領(lǐng)域的科研人員更好的理清 m6A 的研究思路，表觀生物制定以下疾病相關(guān) m6A 研究策略以供參考。

研究案例： FTO 通過 RNA 修飾機(jī)制發(fā)揮促癌作用

2017 年 1 月，辛辛那提大學(xué)研究人員在 Cancer Cell 雜志發(fā)表論文 [9]，報(bào)道了發(fā)現(xiàn)肥胖相關(guān)蛋白 FTO 能夠通過 RNA 修飾機(jī)制調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)，發(fā)揮重要的促癌作用，導(dǎo)致白血病細(xì)胞增多并抑制癌細(xì)胞對(duì)藥物的應(yīng)答。

研究人員利用 100 個(gè)人類急性髓系白血病（AML）樣本以及 9 個(gè)正常對(duì)照樣本的芯片數(shù)據(jù)，還對(duì)其他一些大規(guī)模 AML 樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。他們發(fā)現(xiàn) FTO 在不同亞型的白血病樣本中都存在高表達(dá)。（見圖 10）

圖 .10 FTO 基因在 AML 樣本中存在高表達(dá)

圖 11. FTO 靶向調(diào)控 ASB2 和 RARA 等抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的基因，通過去甲基化修飾后，反向抑制 ASB2 和 RARA 的功能

實(shí)驗(yàn)證明 FTO 靶向調(diào)控 ASB2 和 RARA 等抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的基因，通過去甲基化修飾后，導(dǎo)致靶 mRNA 穩(wěn)定性提高，也相應(yīng)提高了蛋白質(zhì)含量，這個(gè)結(jié)果與之前認(rèn)為的 m6A 導(dǎo)致 mRNA 穩(wěn)定性下降的結(jié)論出現(xiàn)了相反。另外通過沉默 m6A 的識(shí)別蛋白 YTHDF1 和 YTHDF2，發(fā)現(xiàn)只有 YTHDF2 能影響到 ASB2 和 RARA 的 mRNA 水平，但是對(duì)于這兩個(gè)蛋白的豐度卻沒有產(chǎn)生作用。提示還有新的調(diào)控機(jī)制尚待發(fā)現(xiàn)。

文章zui后提出了 FTO---ABS2/RARA 調(diào)控軸的機(jī)制模型：由于融合基因等因素的影響如 MLL-fusion 蛋白等刺激導(dǎo)致 FTO 表達(dá)上升，降低靶基因如 ASB2，RARA 等的 mRNA m6A 修飾，抑制其功能發(fā)揮，促進(jìn)了細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞分化，并且抑制癌細(xì)胞對(duì)藥物的應(yīng)答。

圖 12. 機(jī)制模型

這項(xiàng)研究證實(shí) m6A 修飾機(jī)制在白血病發(fā)育和藥物應(yīng)答過程中有重要作用。靶向 FTO 信號(hào)途徑可能成為治療白血病的一個(gè)新的策略。另外 FTO 也在其他一些實(shí)體瘤中發(fā)揮促癌作用，因此該研究結(jié)果可能對(duì)癌癥生物學(xué)研究和癌癥治療方法的開發(fā)有更廣泛的影響。

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