吖啶橙熒光染色法基本原理:
吖啶橙(acridine orange,AO)是一種常用熒光染料,吖啶橙與原代細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA都有親和力,但有一定的特異性,即結(jié)合后發(fā)不同顏色的熒光,DNA呈亮綠色,而RNA呈橘紅色至火紅色。此法簡便快捷,既可染活原代細(xì)胞又可染固定原代細(xì)胞。用于直接染色觀察活原代細(xì)胞或固定染色觀察原代細(xì)胞均可。吖啶橙對活原代細(xì)胞毒性小,配成1×10-4-2×10-4可用于直接染色活原代細(xì)胞和進(jìn)行熒光顯微鏡觀察,但不持久,用固定染色觀察法效果更好。
材料:
1.蓋片單層培養(yǎng)原代細(xì)胞;
2.固定劑:95%乙醇或乙酸/甲醇(現(xiàn)配);
3.吖啶橙:用生理鹽水配成1%的干液。使用時(shí)再用PBS稀釋成1×10-4-2×10-4mol/L pH4.5-5.0的染色液;
4.0.1mol/L的CaCl2;
5.1%乙酸。
染色步驟:
1.將蓋片單層培養(yǎng)原代細(xì)胞從瓶中取出,立即用溫Hanks液漂洗3-5s,以去除培養(yǎng)基中血清;
2.投入95%乙醇或乙酸/甲醇固定15-30min,用濾紙接觸蓋片邊緣,蓋片微干;
3.用1%乙酸酸化30s;
4.用1×10-4-2×10-4的吖啶橙染液染色30s或1min;
5.用0.1mol/L的CaCl2處理30s-2min;
6.PBS漂洗3次,每次數(shù)秒;
7.PBS封片,熒光顯微鏡下直接觀察并拍照;
8.注意事項(xiàng):觀察中應(yīng)隨時(shí)填加PBS以避免標(biāo)本干涸。如用油浸鏡觀察,需再覆以大蓋片蓋在附有原代細(xì)胞蓋片上,保證原代細(xì)胞面朝上,用無熒光性油浸鏡觀察。原代細(xì)胞蓋片標(biāo)本在95%乙醇中能保存數(shù)日后仍可觀察,如退色,再用AO染色。鏡下觀察,DNA呈翠綠色,RNA呈火紅色。 結(jié)果:原代細(xì)胞核因含DNA呈綠色,細(xì)胞質(zhì)及核仁因含RNA呈紅色。
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