體外細(xì)胞的原代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇，傳代培養(yǎng)

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

1.一只小鼠可獲得（1～2.5）×108個(gè)脾細(xì)胞。

2.細(xì)胞接種后一般幾小時(shí)內(nèi)就能貼壁，并開始生長(zhǎng)，如接種的細(xì)胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。

3.一般情況，傳代后的細(xì)胞在2小時(shí)左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2～4天就可在瓶?jī)?nèi)形成單層，需要再次進(jìn)行傳代。

四、注意事項(xiàng)

1.取材要求新鮮，無(wú)菌，解剖小鼠時(shí)，注意不要損傷脾臟及其周圍的臟器，尤其是腸道等，防止污染脾臟。

2.沖洗脾臟時(shí)要盡量洗凈血污，去除無(wú)用組織，并要防止組織干燥。

3.碾磨后及時(shí)用清水沖洗篩網(wǎng)，防止組織、細(xì)胞阻塞網(wǎng)孔。

4.計(jì)數(shù)前，注意吸盡平皿里的細(xì)胞，充分混勻，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞。

5.實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在操作臺(tái)中央無(wú)菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，勿在邊緣非無(wú)菌區(qū)域操作。

6.金屬器械不能在火焰中燒的時(shí)間過長(zhǎng)，燒過的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織，以免造成組織損傷。

7.另外膠塞過火焰時(shí)也不能時(shí)間長(zhǎng)，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細(xì)胞。

8.吸取過營(yíng)養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營(yíng)養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時(shí)會(huì)把有害物帶入營(yíng)養(yǎng)液中。

9.不能用手觸及已消毒器皿瓶口、瓶塞內(nèi)部，吸管前部等所有可能與細(xì)胞接觸的部分，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。

10.開啟、關(guān)閉長(zhǎng)有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶時(shí)，火焰滅菌時(shí)間要短。防止因溫度過高燒死細(xì)胞。

11.換液時(shí)傾倒廢液，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過快，防止廢液四濺。

12.吹打細(xì)胞時(shí)，要注意邊角的細(xì)胞是否吹打下來(lái)。

13.手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上，即不可以在開放容器上方操作。

14.每次操作只處理一株細(xì)胞，以免造成細(xì)胞交叉污染。

15.注意自身的安全，對(duì)于來(lái)自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心。操作過程中，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑例如DMSO，并避免尖銳物品傷人等。

16.從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液。

17.將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷。

18.凍存和復(fù)蘇用新配制的培養(yǎng)液。