應(yīng)用PCR遺傳工程實驗方法

應(yīng)用PCR遺傳工程實驗方法

1. 設(shè)計與合成預(yù)期的末端修改的寡核苷酸引物。

例如，根據(jù) cDNA 模板設(shè)計的 5'引物為 5' dATCATATGGCTCTG GATGAACT- GTGCCTGCTGGACATGCT3'，3' 引物為 5' dATAAGCTTTTATTAAGACA-GACTCAGCTCATGGGAGGCAA3'，這樣在 cDNA 的 5' 末端引入了 Nde  I (CATATG) 位點，改變了 cDNA 的部分密碼子為大腸桿菌偏愛密碼子。下面劃線的核苷酸表示寡核苷酸引物與 cDNA 模板之間是不同的。對于寡核苷酸引物 3' 末端*配對的堿基對數(shù)目究竟是要求多少對才能成功擴增靶基因尚無定論；然而，具體工作中發(fā)現(xiàn)一般有 8~10 對*配對的堿基對就足夠了。

2. 按以下次序，將各成分加入在 0.5 ml 滅菌離心管，擴增管或滅菌滴定板的孔內(nèi)，混合：

100 ng 模板 DNA                   10 μl

10X 擴增緩沖液                      5 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液   5 μl

10 μmol/L 引物 1 ( 50 pmol )    5 μl

10 μmol/L 引物 2 ( 50 pmol )    5 μl

1~2 單位熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶    1 μl

H2O 補足至                            50 μl

設(shè)置二支對照反應(yīng)管，加入以上除了模板 DNA 的所有試劑。在其他反應(yīng)中，加 入包含模板 DNA 的所有以上試劑。通過 PCR 預(yù)期會產(chǎn)生陽性結(jié)果。試驗管與對照管一同進(jìn)行所有后續(xù)的實驗步驟。

3. 如果 PCR 儀沒有配制加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層應(yīng)加一滴礦物油（約 50 μl)，防止樣品在 PCR 反應(yīng)多個加熱與冷卻的循環(huán)過程中蒸發(fā)。如果應(yīng)用熱啟動 PCR 程序，在反應(yīng)混合液的上層加一層石蠟油。放置離心管和微量滴定板在 PCR 儀上。

4. 按以下方法進(jìn)行 PCR 擴增。典型的程序有變性、復(fù)性和聚合（延伸反應(yīng)）；相應(yīng)的循環(huán)條件與溫度列表如下：

5. 抽取每種擴增樣品 5%~10%, 用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析擴增結(jié)果，用 DNA marker 來判斷擴增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠）或 SYBR 金顆粒染色后來觀察擴增的量與片段大小。

—次成功的擴增反應(yīng)應(yīng)該產(chǎn)生與我們預(yù)期大小一致的 DNA 片段。擴增條帶可用 DNA 序列分析，SoutKem 雜交和限制性內(nèi)切核酸酶酶切圖譜予以鑒定。

6. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內(nèi)樣品液體的上層（步驟 3)，反應(yīng)結(jié)束后可用 150 μl 抽提去除。

7. 為了后續(xù)的克隆，對 DNA 擴增片段應(yīng)用相應(yīng)的限制性內(nèi)切核酸酶進(jìn)行消化（酶切位點由引物的 5' 末端導(dǎo)入，上述例子應(yīng)用 NdeⅠ和 HindⅢ）。應(yīng)用凝膠電泳或超濾方法純化酶解片段。

8. 用預(yù)期的載體 DNA 建立適當(dāng)?shù)倪B接反應(yīng)，連接反應(yīng)中插入片段與載體的摩爾比率為 3:1。

應(yīng)用PCR遺傳工程實驗方法