Megazyme 比色法用低聚糖 FAQs （1）

Q: 4-硝基苯糖苷酶底物如何應(yīng)用于比色法測(cè)定酶活性？

A: 酶溶液稀釋: 將酶制劑稀釋到適當(dāng)?shù)姆治鼍彌_液中(100 mM 0.1 mg/mL 牛血清白蛋白，在酶經(jīng)檢測(cè)*pH范圍內(nèi))。初始的1:100稀釋液置于一個(gè) 100 mL容量瓶中，隨后加入10倍的稀釋液以獲得合適的酶溶液濃度。40攝氏度下，水浴加熱酶稀釋液5分鐘進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。

加底物: 0.2 mL pNP底物 (10 mM)分別加入8個(gè)玻璃試管中(4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的重復(fù)樣本)，40攝氏度水浴培養(yǎng)5分鐘。

酶反應(yīng): 0.2 mL酶(按步驟 4.23制備)分別加入含有底物的玻璃試管中，渦旋混合，并在40度水浴中培養(yǎng)重復(fù)樣本3，6，9，和12分鐘。在培養(yǎng)接近終點(diǎn)時(shí)，加入3.0 mL 2% 磷酸三鈉溶液以終止反應(yīng)，并立即快速渦旋混合。

反應(yīng)空白樣: 將3.0 mL 2% 磷酸三鈉加入2個(gè)玻璃試管中，然后加入0.2 mLpNP-底物 (10 mM)并渦旋混合，接著分別加入0.2 mL酶到2個(gè)試管中并立即渦旋混合。在室溫下培養(yǎng)。

在400nm下檢測(cè)所有樣品的吸光度

用水為分光光度計(jì)歸零。

檢測(cè)兩個(gè)空白樣 (記錄數(shù)值，然后根據(jù)其一將分光光度計(jì)歸零 – 設(shè)定這兩個(gè)值很接近).

檢測(cè)其余樣品的吸光度

根據(jù)吸光度和培養(yǎng)時(shí)間繪制吸光度曲線，并將結(jié)果用于計(jì)算。

計(jì)算:

1個(gè)單位酶活性，是每分鐘在*pH和40攝氏度下將1微摩爾PNP底物水解成pNP和底物所需要的酶的數(shù)量。

按以下公式進(jìn)行計(jì)算:

U/mL = (A400 /按分鐘計(jì)的反應(yīng)時(shí)間) x (按毫升計(jì)的總反應(yīng)體積 / 按毫升計(jì)的酶溶液體積) x (1 / pNP的消光系數(shù)) x 酶稀釋因子

U/mL = (A400 / 分鐘) x (3.4 mL / 0.2 mL) x (1 / 18.1) x 稀釋因子

在這里:

A400/min = 吸光值 (反應(yīng))/分鐘 – 吸光值 (空白)/分鐘.

培養(yǎng)時(shí)間 = 10 min.

細(xì)胞總體積 = 3.4 mL

分析的等分體積 = 0.2 mL

2% 磷酸三鈉中pNP的消光系數(shù) = 18.1

該計(jì)算設(shè)定,在記錄吸光度變化的整個(gè)10分鐘反應(yīng)期內(nèi)，反應(yīng)速率呈線性分布。如果實(shí)際情況并非如此，則使用zui高反應(yīng)速率來(lái)替代2-10分鐘時(shí)間內(nèi)記錄的速率