菌種的保存

1 斜面低溫保藏法

將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長(zhǎng)后，棉塞部分用油紙包扎好，移至 2—8℃的冰箱中保藏。

保藏時(shí)間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存 2—4 個(gè)月，移種一次。酵母菌兩個(gè)月，細(xì)菌每月移種一次。

2 液體石蠟保藏法

1. 將液體石蠟分裝于三角燒瓶?jī)?nèi)，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌 30 分鐘，然后放在 40℃溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉，備用。
2. 將需要保藏的菌種，在zui適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子。
3. 用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長(zhǎng)好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端 1cm 為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。
4. 將試管直立，置低溫或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時(shí)間還要長(zhǎng))。

3 濾紙保藏法

1. 將濾紙剪成 0.5×1.2cm 的小條，裝入 0.6×8cm 的安瓿管中，每管 1—2 張，塞以棉塞，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌 30 分鐘。
2. 將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長(zhǎng)。
3. 取滅菌脫脂牛乳 1—2ml 滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，制成濃懸液。
4. 用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi)，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。
5. 將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。
6. 將棉花塞入管內(nèi)，用火焰按圖Ⅶ-13 熔封，保存于低溫下。
7. 需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時(shí)，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后，取出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。

4 沙土保藏法

1. 取河沙加入 10%稀鹽酸，加熱煮沸 30 分鐘，以去除其中的有機(jī)質(zhì)。
2. 倒去酸水，用自來(lái)水沖洗至中性。
3. 烘干，用 40 目篩子過(guò)篩，以去掉粗顆粒，備用。
4. 另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅土，加自來(lái)水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。
5. 烘干，碾碎，通過(guò) 100 目篩子過(guò)篩，以去除粗顆粒。
6. 按一份黃土、三份沙的比例(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土)摻合均勻，裝入 10×100mm 的小試管或安瓿管中，每管裝 1g 左右，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌，烘干。
7. 抽樣進(jìn)行無(wú)菌檢查，每 10 支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng) 48 小時(shí)，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌，再作無(wú)菌試驗(yàn)，直至證明無(wú)菌，方可備用。
8. 選擇培養(yǎng)成熟的(一般指孢子層生長(zhǎng)豐滿的，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞用此法效果不好)優(yōu)良菌種，以無(wú)菌水洗下，制成孢子懸液。
9. 于每支沙土管中加入約 0.5ml(一般以剛剛使沙土潤(rùn)濕為宜)孢子懸液，以接種針拌勻。
10. 放入真空干燥器內(nèi)，用真空泵抽干水分，抽干時(shí)間越短越好，務(wù)使在 12 小時(shí)內(nèi)抽干。
11. 每 10 支抽取一支，用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒，接種于斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況和有無(wú)雜菌生長(zhǎng)，如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長(zhǎng)，則說(shuō)明制作的沙土管有問(wèn)題，尚須進(jìn)一步抽樣檢查。
12. 若經(jīng)檢查沒(méi)有問(wèn)題，用火焰熔封管口，放冰箱或室內(nèi)干燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌情況。
13. 需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時(shí)，取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。

5 液氮冷凍保藏法

1. 準(zhǔn)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用 75×10mm 的，或能容 1.2mm 液體的。
2. 加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí)，則將空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌 15 分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如 10%的甘油蒸餾水溶液或 10%二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒(méi)以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌 15 分鐘。
3. 接入菌種將菌種用 10%的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管;霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無(wú)漏洞。
4. 凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降 1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。
5. 保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。
6. 恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時(shí)，將安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

?6 冷凍干燥保藏法

1. 準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長(zhǎng)頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管(圖Ⅶ-15)，大小要求外徑 6—7.5mm，長(zhǎng) 105mm，球部直徑 9—11mm，壁厚 0.6—1.2mm。也可用沒(méi)有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌 30 分鐘，備用。
2. 準(zhǔn)備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年，為了在許多年后不出差錯(cuò)，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在zui適培養(yǎng)基中用zui適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，若用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種進(jìn)行保藏，其存活率反而降低。一般，細(xì)菌要求 24—48 小時(shí)的培養(yǎng)物;酵母需培養(yǎng) 3 天;形成孢子的微生物則宜保存孢子;放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng) 7—10 天。
3. 制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例，用脫脂牛乳 2ml 左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝 0.2ml。
4. 冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價(jià)值昂貴，此處介紹的是簡(jiǎn)易方法與裝置，可達(dá)到同樣的目的。將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無(wú)低溫冰箱可用冷凍劑如干冰(固體 CO2>)酒精液或干冰丙酮液，溫度可達(dá)-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍 4—5 分鐘，即可使懸液結(jié)冰。
5. 真空干燥為在真空干燥時(shí)使樣品保持凍結(jié)狀態(tài)，需準(zhǔn)備冷凍槽，槽內(nèi)放碎冰塊與食鹽，混合均勻，可冷至-15℃。裝置儀器如圖Ⅶ-16，安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶?jī)?nèi)。抽氣一般若在 30 分鐘內(nèi)能達(dá)到 93.3Pa(0.7mmHg)真空度時(shí)，則干燥物不致熔化，以后再繼續(xù)抽氣，幾小時(shí)內(nèi)，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥，一般抽到真空度 26.7Pa(0.2mmHg)，保持壓力6—8 小時(shí)即可。封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用 L 形五通管(圖Ⅶ-17)繼續(xù)抽氣，約 10 分鐘即可達(dá)到 26.7Pa(0.2mmHg)。于真空狀態(tài)下，以煤氣噴燈的細(xì)火焰在安瓿管頸中央進(jìn)行封口。封口以后，保存于冰箱或室溫暗處。