miRNA靶基因預測與驗證相關問題解答

miRNA主要通過與靶mRNA的結合，或促使mRNA降解，或阻礙其翻譯，從而抑制目的基因的表達。用生物信息學方法準確快速地預測miRNA的靶基因，可以為研究miRNA功能提供線索。 

下面總結一些熒光素酶實驗中常見的問題。  

1轉染成功如何判斷？ 
 

共轉染的幾個質(zhì)粒中，3' UTR質(zhì)粒及Renilla質(zhì)?？赏ㄟ^zui終的luc讀值判斷是否轉染成功，而miRNA質(zhì)粒或mimic的轉染情況無法從zui終的luc讀值做出判斷，因而針對miRNA，轉染是否成功可用以下方法進行： 
i.如轉入的miRNA帶熒光標記如GFP，則可直接在轉染后、細胞裂解前，顯微鏡下觀察細胞熒光； 
ii.如轉入的miRNA不帶任何熒光標記，可考慮進行miRNA的qRT-PCR檢測，通過檢測結果判斷實驗組2、4、6是否相對其對照組miRNA有顯著過表達。 
iii.設置一個熒光質(zhì)粒轉染參照組，同批轉染一個組的細胞，間接反映出同批次實驗的轉染情況。  
 

2如何判斷實驗體系無異常，獲得客觀的實驗結果？ 可以從以下幾個方面來考察實驗結果的客觀性： 

對照的2個實驗組，即實驗組1與實驗組2 luc表達情況應無顯著差異； 轉染正常，質(zhì)粒或mimic確保成功轉染入細胞； luc檢測值在儀器檢測線性范圍內(nèi)。  
 

3 陰性結果如何理解？ 

在確保實驗體系無異常的前提下，如果zui終檢測到的結果是陰性結果，則基本可以判斷目的miRNA不能直接調(diào)控靶基因的表達，不死心的話就再做一次，如果仍然是陰性結果，死心吧。 
有的同學說我一次做出陽性結果一次做出陰性結果咋辦？那就恭喜你再重復吧，結果一直波動的話可能是實驗系統(tǒng)或其他原因，  
 

4為何與文獻報導有差異？ 

實驗中，我們往往會遇到無法重復出文獻中結果的問題，這是肯定的，不同實驗室實驗條件、實驗材料、實驗細節(jié)并不能確保與文獻*一致所致。因此，只要我們相信自己就行。  
 

5實驗體系是否可以優(yōu)化？如何優(yōu)化？

該實驗的關鍵點在細胞狀態(tài)和轉染效率，轉染效率的優(yōu)化可通過調(diào)整共轉染質(zhì)粒的比例或調(diào)整轉染體系來進行，設置合理的質(zhì)粒轉染量梯度，觀察microRNA對靶基因的抑制是否存在劑量效應或是否存在變化趨勢的一致性，從而使結論更加可靠。  
 

6使用mimics的一些問題？ 

有的同學喜歡使用mimics來做實驗，其實mimics就是體外合成的成熟體miRNA，同樣可以反轉錄，用qRT-PCR來檢測表達量，但是大家應該很少看到有文章把mimics的過表達量PCR結果放出來的吧，那是因為mimics的過表達通常在數(shù)萬到數(shù)十萬倍，miIRNA通常會靶向結合許多靶基因，這么強的外源過表達肯定會引起嚴重的脫靶效應，給審稿人把柄質(zhì)疑你嗎？對于這種找抽的行為大家肯定是積極規(guī)避的。質(zhì)粒介導的miRNA過表達由于是模擬了前體在生物體內(nèi)的剪切，其過表達通常在數(shù)十倍到數(shù)百倍，可能引起的脫靶效應遠沒有mimics嚴重。 
 
7是否還有其他方法驗證miRNA對靶基因表達的調(diào)控？ 

驗證miRNA對靶基因的調(diào)控，也可直接檢測miRNA過表達或下調(diào)表達后，靶基因在mRNA（qRT-PCR方法）或蛋白水平上的變化（Western Blot方法）。