探究磁珠法蛋白純化失敗的真相

磁珠法蛋白純化越來(lái)越受到很多科研小伙伴的青睞，使用磁珠純化方法比填料柱方法操作更加便捷、磁珠的載量更高、獲取的蛋白純度更高。

在磁珠法蛋白純化被逐漸接受的同時(shí)，有的用戶(hù)由于剛接觸磁珠法蛋白純化，對(duì)于磁珠法的原理、性能不熟悉，導(dǎo)致純化過(guò)程中遇到些問(wèn)題，今天小編就用戶(hù)使用磁珠過(guò)程中經(jīng)常遇到的問(wèn)題，科普一番，開(kāi)啟我們探究磁珠法蛋白純化失敗的真相之旅！

His-tag蛋白純化磁珠原理
His-tag蛋白純化磁珠是在瓊脂糖微球的內(nèi)部填充磁性?xún)?nèi)核，在表面固定金屬離子Ni2+或Co2+，Ni2+或Co2+可以和蛋白His標(biāo)簽中組氨酸形成配位鍵，將目標(biāo)蛋白結(jié)合到磁珠上，后通過(guò)磁性分離器分離出來(lái)。
純化結(jié)果分析的依據(jù)：電泳圖、緩沖液配方和蛋白性質(zhì)
建議用戶(hù)用粗蛋白液、流穿液（蛋白結(jié)合到磁珠上剩余的液體）、洗滌液、洗脫液跑SDS-PAGE凝膠電泳，以便分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
緩沖液配方中不得不提兩個(gè)關(guān)鍵物質(zhì)咪唑濃度和鹽離子濃度。
1.咪唑與標(biāo)簽蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磁珠表面的金屬離子，因此緩沖液中咪唑濃度可以影響獲得目的蛋白的純度和目的蛋白獲得率。一般推薦梯度洗脫，獲取目的蛋白。
2.鹽離子濃度可以影響蛋白質(zhì)的溶解度，從而影響蛋白與磁珠的結(jié)合能力。稀濃度鹽離子可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，高濃度中性鹽會(huì)破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)溶解度降低。

蛋白純化失敗分析

一、目的蛋白純度低
當(dāng)純化得到的目的蛋白純度低時(shí)，可以增加洗滌液中（washing buffer）咪唑濃度。雜蛋白與磁珠結(jié)合力比較弱，增加洗滌液中咪唑濃度這樣可以將結(jié)合在磁珠上雜蛋白洗滌下來(lái)。這里有一個(gè)典型的例子分享給大家。

從電泳圖中可以看出，當(dāng)洗滌液中咪唑由60mM增加達(dá)到100mM時(shí)，雜蛋白不見(jiàn)啦，這一招你get了嗎？
二、目的蛋白量少
當(dāng)出現(xiàn)純化后目的蛋白的量少時(shí)，通常有這三種情況：
1.粗蛋白液中蛋白大部分在沉淀里，上清液中蛋白量少
解決建議：根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)調(diào)節(jié)鹽離子濃度增加蛋白的溶解度。增加磁珠的量，提高蛋白結(jié)合上磁珠的幾率。
2.上清液中蛋白濃度大，流穿液中蛋白濃度也大
解決建議：說(shuō)明蛋白沒(méi)有結(jié)合到磁珠上，可以降低咪唑濃度、降低鹽離子濃度來(lái)增加蛋白與磁珠的結(jié)合力。還有一種可能目標(biāo)蛋白沒(méi)有his標(biāo)簽，建議Western blot確認(rèn)標(biāo)簽，重新構(gòu)建載體。
3.上清液中蛋白濃度大，流穿液中蛋白濃度少，洗脫液中蛋白濃度低
解決建議：說(shuō)明蛋白在磁珠上沒(méi)有洗脫下來(lái)，建議增加洗脫液中咪唑濃度到500mM。或者取洗脫后的磁珠放于沸水中煮5min后，取剛煮過(guò)磁珠的液體跑電泳驗(yàn)證。