◆背景

　　此方法用于分析檢測(cè)果汁成品或原料。此文件細(xì)節(jié)性地描述了嗜熱嗜酸菌（以下縮寫為TAB）的定量檢測(cè)和其確認(rèn)測(cè)試。此文件含有關(guān)于TAB的定義，描述和其他的相關(guān)信息。

◆原理

　　在濃縮果汁，特定甜味劑和一些飲料中，TAB（脂環(huán)酸芽孢桿菌）主要以孢子的形式存在。這些孢子的活性往往在高溫殺菌，并且有合適的生長(zhǎng)環(huán)境的條件下增長(zhǎng)。TAB不會(huì)在冷飲中生長(zhǎng)。如果環(huán)境允許，TAB會(huì)生成一種名為愈創(chuàng)木酚的化合物。此化合物會(huì)給產(chǎn)品和原料帶來一種藥的味道。基于此藥味，樣品被認(rèn)為是腐壞了。

◆原料和標(biāo)準(zhǔn)品

      a．酵母提取物（212759，BD）

      b．葡萄糖（215530，BD）

      c．可溶性淀粉（217820，BD）

      d．瓊脂（214530）

      e．愈創(chuàng)木酚測(cè)試套裝

◆儀器設(shè)備

      a．水浴鍋

      b．培養(yǎng)箱

◆實(shí)驗(yàn)過程

      a．培養(yǎng)基（YSG）配制

      i．溶液A：在1L燒杯中稱量2g酵母提取物，1g葡萄糖和2g可溶性淀粉。加入500mL去離子水溶解。加入適量1N的鹽酸或硫酸，使pH調(diào)整至3.7±0.1。

      ii．溶液B：取一個(gè)新的1L的燒杯。稱量15g瓊脂并加入500mL去離子水加熱溶解。

      iii．在121°C下蒸汽滅菌15分鐘。

      iv．當(dāng)溶液A和B的溫度都降至47±0.2°C時(shí)，在無菌條件下將溶液A倒入溶液B中混合。

      v．在培養(yǎng)皿中倒入15至20mL配置完成的培養(yǎng)基（YSG）并使其凝固。將澆好的培養(yǎng)皿放入冰箱中存放。保質(zhì)期為一個(gè)月。

      b．樣品準(zhǔn)備（熱擊）

      i．在試管中準(zhǔn)備9mL的無菌水，在無菌條件下加入1mL濃縮果汁并混勻。

      ii．將試管置于80°C水浴鍋中熱擊。當(dāng)樣品溫度到達(dá)80±0.2°C時(shí)計(jì)時(shí)10分鐘。然后快速降溫至室溫。

      iii．如果樣品為單倍果汁，則無需稀釋。

      c．樣品分析方法

      i．涂布法（用于不可過濾的樣品）：

         1．向固體YSG培養(yǎng)基中加入1mL熱擊過的稀釋樣品（單倍果汁無需稀釋，直接取1mL樣品）。將樣品均勻涂抹在培養(yǎng)基表層。

        2．將平板正放于45±2°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一天。

        3．一天后倒置平板并繼續(xù)培養(yǎng)4天。

      ii．膜過濾法（用于可過濾樣品）：

        1．在50mL無菌水中加入熱擊過的稀釋樣品（單倍果汁無需稀釋，直接取10mL樣品加入）。混勻后用0.45µm濾膜過濾。

        2．在無菌條件下將濾膜轉(zhuǎn)移至固體YSG培養(yǎng)基上。

        3．倒置平板，在45±2°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。

      d．結(jié)果分析

        i．如果樣品中菌落計(jì)數(shù)小于原料標(biāo)準(zhǔn)要求，用愈創(chuàng)木酚測(cè)試套裝進(jìn)一步檢測(cè)會(huì)有無產(chǎn)生鄰甲氧基苯酚的微生物。如果菌落計(jì)數(shù)大于原料標(biāo)準(zhǔn)要求，則直接認(rèn)定為不合格樣品。

        ii．陽性平板應(yīng)通過顯微鏡鏡檢來確定脂環(huán)酸芽孢桿菌的存在。

        iii．每一套測(cè)試樣品需要有控制平板做比對(duì)。包括空氣，陽性菌對(duì)比，YSG培養(yǎng)基和樣品所使用的無菌水。

      e．愈創(chuàng)木酚測(cè)試套裝

        i．用接種環(huán)取10 µL不含孢子的新鮮菌落，懸浮于含有“Va-YSG 試劑 (2mL)”的試管中（≥1×108cfu/mL）。

        ii．在45±1°C下培養(yǎng)3小時(shí)或過夜。

        iii．加入1mL鄰甲氧基苯酚測(cè)試套裝試劑1。

        iv．加入20µL鄰甲氧基苯酚測(cè)試套裝試劑2。

        v．加入20µL鄰甲氧基苯酚測(cè)試套裝試劑3。

        vi．混勻并放置5－10分鐘。

        vii．觀察溶液的顏色變化。在10分鐘內(nèi)讀取數(shù)據(jù)。

        viii．陽性控制：取2mL純凈水和100µL陽性控制并混合。重復(fù)步驟iii－vii。

        ix．空白：取新的“Va-YSG”試劑并重復(fù)步驟ii－vii。

◆質(zhì)量控制檢測(cè)

      a．這項(xiàng)測(cè)試需要含有少量TAB陽性菌的可過濾果汁樣品作為過程檢查。

      b．向10mL離心管中加入1mL陽性樣品（濃縮）。加入9mL無菌水或緩沖劑。

      c．80±2°C熱擊10分鐘。

      d．取1mL樣品至50mL無菌水中混合。

      e．過濾并把陽性控制儲(chǔ)藏在冷凍（-18°C）條件下。

產(chǎn)品信息鏈接：愈創(chuàng)木酚測(cè)試套裝