酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測豬繁殖與呼吸綜合征

Albina等（1992）用PRRSV接種PAM培養(yǎng)，提取PRRSV抗原，建立了檢測PRRSV抗體的間接ELISA，當(dāng)PRRSV抗原孔的OD值與細(xì)胞抗原孔的OD值之比大于1．5時，即判斷樣品為陽性。研究發(fā)現(xiàn)ELISA的特異性與IPMA相同，但敏感性更高。由于PAM為原代細(xì)胞，難以獲得足夠的細(xì)胞用于制備
PRRSV抗原，Takikawa等（1996）用PRRSV接種MARCl45細(xì)胞提取PRRSV抗原，建立了檢測PRRSV抗體的ELISA方法，結(jié)果表明，ELISA具有比IPMA和IFA更好的特異性和敏感性。由于用MAR~145制備的PRRSV抗原有一定程度的非特異性反應(yīng)，因此有必要進一步改進。Cho等（1996）利用Triton-X100助溶，從PRRSV感染的MARC-145細(xì)胞中制備出高純度的E1．ISA抗原，這種高質(zhì)量的抗原應(yīng)用到檢測PRRSV抗體的間接ELISA中，輔以一種有效的封閉劑可消除血清樣品的非特異性反應(yīng)，且這種ELISA比1FA敏感，特別是對感染后期血清具有高度的特異性；具有快速、經(jīng)濟、敏感、適合大量樣品的檢測、可半自動和自動顯示結(jié)果等優(yōu)點，明顯優(yōu)于IPMA和IFA，目前ELISA已作為PRRS檢測診斷的常規(guī)手段。

當(dāng)前，病毒病診斷技術(shù)的發(fā)展趨向于特異強、敏感性高、快速、經(jīng)濟、操作安全簡單，能夠達到的早期診斷目的，適于大量樣品的檢測，而且診斷技術(shù)都趨向于試劑盒化，PRRS的診斷也不例外。目前，美國IDEXX公司生產(chǎn)用于PRRS的ELISA診斷試劑盒在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用，國內(nèi)PRRS的診斷試劑盒的市場幾乎被美國IDEXX公司壟斷，而這種進口ELISA試劑盒價格昂貴，只有條件較好的豬場和實驗室才能負(fù)擔(dān)得起。然而，該ELISA試劑盒是用PRRSV全病毒包被酶標(biāo)板（Steven，et a1，2000），因此，生產(chǎn)廠商要求使用完畢的試劑盒材料必須進行焚燒處理；如果在操作或處理上出現(xiàn)失誤，就會存在潛在散毒的危險，我國PRRS的流行也許與該試劑盒的引進和使用不當(dāng)有關(guān)。所以，有必要研究安全不散毒、敏感性高特異性強的PRRSELISA診斷方法。

用重組蛋白作為靶抗原來建立血清學(xué)診斷方法就可避免散毒這一弊端，因PRRSV的N蛋白很保守并具有*的免疫原性，所以，在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上建立起來的血清學(xué)檢測方法都是以原核或真核表達的重組N蛋白為基礎(chǔ)（Dea，et a1，2000b~Denac，et a1，1997~Steven，eta[，200％Meulenberg，etal，1995b）。Dea等（2000）用原核表達的重組N蛋白直接溶于4mol／L的鹽酸胍，用PBS稀釋后就可用于血清學(xué)方法的研究，成功地建立了檢測PRRSV抗體的ELlSA方法，在感染后的7～10天，可從血清內(nèi)檢測出PRRSV抗體；與1DEXX公司商品化的ELISA診斷試劑盒同時檢測542份豬血清，二者檢測結(jié)果*一致；將5個表位全部（ORF7）或分段進行表達發(fā)現(xiàn)，只有完整的重組N蛋白（原核表達）才適合用于PRRS血清學(xué)診斷方法的研究（Dea，etal，2000b）。ORF7也有在桿狀病毒表達系統(tǒng)中獲得表達的報道，所建立的ELISA也顯示出較好的診斷效果，但桿狀病毒表達系統(tǒng)的表達量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及原核表達豐富，且所需試驗條件及成本高，并且昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)時加入的胎牛血清易給血清學(xué)反應(yīng)造成非特異性反應(yīng)，因此，實際應(yīng)用受到了限制（Denac，etal，1997~Steven，etal，2000）。國內(nèi)研究者也對ORF7在兩個系統(tǒng)的表達進行了研究（仇華吉等，1999。；王云峰等，2000~趙耘等，2001），但沒有一個真正試劑盒化的方法出現(xiàn)并應(yīng)用于PRRS的診斷。M蛋白是歐、美型PRRSV毒株之間zui保守的蛋白，且有較強的免疫原性，在感染后的第10天就可檢測出相應(yīng)的抗體（Meng，et al，1995b~Loemba，et al，1996），因此，PRRSV的M蛋白同樣可作為PRRS診斷的靶抗原，但國內(nèi)外還沒有將M蛋白進行表達研究和用于建立診斷方法的報道。如果將N蛋白與M蛋白進行融合表達，用重組蛋白MN建立的ELISA方法也許會得到更好的效果，這一方法值得探討。