HRP辣根過氧化物酶分光光度法測定

摘要研究了以辣根過氧化物酶
-苯酚
-4-氨基安替比林反應顯色新體系，檢測黃嘌呤氧化酶（XOD）活力的
新方法。確定該酶活性測定的*條件為：辣根過氧化物酶（
HRP）7000 U /L，4-氨基安替比林（
AAP）
1 mmol / L，苯酚（PA）6 mmol / L，黃嘌呤（XAN）1 mmol / L溶于
50 mmol / L Tris-CL緩沖液（pH 8.4）；反應溫度
為
37℃，保溫時間為
20 min；檢測波長為
508 nm。本方法測定
XOD酶活的線性范圍為5.0～100.0 U /L，線性
關系良好（r
= 0. 9992），檢出限為
1.3 U /L。該方法操作簡單易行，測定結果準確可靠。可有效應用于普通實
驗室和臨床常規(guī)生化檢測。

關鍵詞黃嘌呤氧化酶，辣根過氧化物酶，酶的活力測定，分光光度法

1引言

黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD，EC1. 2. 3. 22）是一種鉬羥類胞質綴合酶。主要用于痛風、
心肌梗塞和細胞損傷后次黃嘌呤和黃嘌呤水平的檢測［1～3］。目前測定黃嘌呤氧化酶活力主要采用
NBT / MTS-PMS比色法、紫外分光光度法、電化學法及放射化學法［4～8］等方法。但比色法形成的顯色物
溶解度低，
PMS對
XOD活性有一定的抑制，且
NBT、MTS和
PMS試劑昂貴。紫外分光光度法中黃嘌呤
和尿酸的紫外吸收波長較接近，直接進行紫外檢測，干擾嚴重。其余兩種方法操作繁瑣，儀器設備要求
高而難于推廣。本實驗根據(jù)辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）［9］和黃嘌呤氧化酶的反應特
性，提出了用
XOD偶聯(lián)辣根過氧化物酶，直接測定黃嘌呤氧化酶活力的新方法。

2實驗部分

2. 1儀器和試劑
U-300型紫外
-可見分光光度儀（日本日立公司）；H. H. S 11-2R恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）；
高速冷凍離心機（日本
Hitachi CR22G型）。0.67 U /mg黃嘌呤氧化酶（
Sigma公司）；250 U /mg辣根過
氧化物酶（上海雙向西巴斯科技有限公司）；4-氨基安替比林（
AR，華東師范大學化工廠）；苯酚（
AR，國
藥集團上?；瘜W試劑公司）；黃嘌呤（99%，F(xiàn)luka）；Tris（BR，國藥集團化學試劑有限公司）；HCL（
AR，國
藥集團上?；瘜W試劑公司）；疊氮鈉（BR，廈門新隆達試劑有限公司）。

2. 2實驗方法
配制反應顯色液：
4-氨基安替比林（4-Aminoantipyrine，AAP），1 mmol / L；苯酚（
phenic acid，PA），
6 mmol / L；Tris-HCL緩沖液，
50 mmol /L；疊氮鈉，
0. 02%；辣根過氧化物酶（
horseradish peroxidase，
HRP），7000 U /L。在具塞試管中，依次加入
3 mL反應顯色液，黃嘌呤（
xanthine，XAN）溶液
100 μL，黃
嘌呤氧化酶（XOD）酶液
50 μL?；靹颍?
37℃下加熱
20 min，煮沸
5 min終止反應。以不加
XOD反應
體系作為參比，測定
UV-Vis譜。

2. 3樣品處理
Arthrobacter
g-X菌株液體發(fā)酵
48 h后，在
10000 r / min轉速下離心
15 min，收集細胞。再將其懸浮
于
50 mmol / L Tris-HCL緩沖液（pH 7.5）中，采用
250 W超聲處理
15 min。然后用
12000 r / min轉速離
心
10 min，取其上清液測定酶活。

2005-08-30收稿；
2005-12-05接受
本文系福建省自然科學基金（No. C0410006）和工業(yè)生物技術*重點實驗室基金（
No. KLIB-KF200502）資助項目

分析化學第
34卷

結果與討論

3. 1酶法測定原理
黃嘌呤氧化酶在催化黃嘌呤氧化的反應過程中，每氧化
1 mol黃嘌呤，將消耗
1 mol分子氧和水，產
生
1 mol尿酸和
1 mol H2O2
。H2O2
再經過氧化物酶作用分解，可使
4-氨基安替比林與苯酚形成亞醌類
呈紅色的化合物（chromogen）［10］。在可見光范圍內測定該顯色化合物的吸光度，即可推算出
XOD的酶
活?？偡磻饺缦拢?/p>

XODXanthine + O2 + H2O %
%%7Uric acid + H2O（1）

HRDH2O2 +AAP+PA%
%%7chromogen + H2O（2）

3. 2反應體系主要參數(shù)的確定
3. 2. 1吸收光譜全波長掃描分析按實驗方法依次加入除
XOD的所有試劑，以
Tris-HCL緩沖液為參
比，掃描該體系的
UV-Vis圖譜。如圖
1曲線
1所示，僅在紫外區(qū)有
1個吸收峰。加入
XOD反應后再掃
描體系的
UV-Vis譜。從譜圖曲線
2可看出產物在可見光區(qū)450～650 nm之間只有
1個吸收峰，選擇吸
收峰值zui高的波長
508 nm作為
XOD酶活檢測波長，可降低干擾。圖中曲線
3在可見光區(qū)沒有任何吸
收峰，說明若不添加辣根過氧化物酶，體系無法形成
紅色亞醌類化合物，即不能進行
XOD的檢測。
3. 2. 2酶促反應溫度的確定在相同反應條件下，
考察了不同反應溫度對
XOD酶活的影響。結果表
明（表
1），隨著溫度的升高，體系吸光度先增大后減
少，即顯色物的生成量先增后減。在
37℃時，顯色
物的吸光度zui高。因而選擇
37℃作為檢測溫度，可
獲*反應效果。
表
1溫度對
XOD酶促反應體系的影響

Table 1 The effect of temperature on the XOD reaction system
溫度（
℃）
32 35 37 40 48Temperature

A580 0. 2328 0. 2797 0. 3193 0. 2805 0. 2631

反應條件（reaction conditions）：t
= 20 min；pH 8.6。

3. 2. 3酶催化反應動力學性質分別按
3. 2實驗
方法同時進行反應，在反應后
1、3、6、9、10、12、13、
18、20、25及
30 min時終止反應，測其吸光度，結果
見圖
2。由圖
2可以看出，在
XOD加入測定體系
圖
1 XOD檢測反應體系的
UV-Vis掃描圖譜
Fig. 1 Absorption spectra for system of anthine oxidase
catalyzing reaction

1.加黃嘌呤氧化酶前的體系（
without xanthine oxidase）；2.加
黃嘌呤氧化酶后的體系（
with xanthine oxidase added）；3.不加
辣根過氧化物酶的體系（
without horseradish peroxidase）；檢測
條件（
determination conditions）：辣根過氧化物酶（
horseradish
peroxidase，HRP）7000U / L，4-氨基安替比林（
4-aminoantipyrine，
AAP）1 mmol / L，苯酚（
phenic acid，PA）6 mmol / L，黃
嘌呤（
xanthine，XAN）1 mmol / L，黃嘌呤氧化酶（
xanthine
oxidase，XOD）49.3 U /L。
后，吸光度值隨反應時間增加逐漸增大。在
20 min后，吸光度值達到zui大，用
Amax
表示。用一級動力學
方程描述吸光度與時間之間的關系曲線得到圖
3，結果顯示該體系反應很好地符合一級反應，動力學方
程為：ln（Amax -At）= -0. 1724t
-1. 2326，相關系數(shù)
r
= 0. 9973。雖然體系中包含兩步酶反應，但是由于
HRP的催化效率*，H2O2
一經生成立刻分解出初生態(tài)氧，而且
H2O2
氧化苯酚反應比黃嘌呤的氧化反

應要快得多，故該體系的綜合反應是準一級反應。

3.2. 4酶促反應體系
pH的選擇在
XOD和
HRP兩種酶的穩(wěn)定
pH范圍內，考察了
6個不同
pH對酶活力的影響。結果表明（表
2），pH對反應
體系有明顯的影響。在
pH8.0～8.4范圍內，隨著
pH的提高，顯色吸光度增大。故確定該反應體系
的zui適
pH為
8. 4。
表
2體系
pH對
XOD酶活檢測的影響
Table 2 The effect of pH on the determination of XOD reaction
system

pH 7.5 8.0 8.2 8.4 8.6 9.0

A508 0. 1339 0. 1385 0. 1754 0. 1801 0. 1527 0. 1262
反應條件（reaction conditions）：T
= 37℃，20 min。

第
6期李忠琴等：辣根過氧化物酶分光光度法測定黃嘌呤氧化酶的活性

圖
2反應體系測定
XOD的吸光度隨時間變化的曲線
圖
3 XOD-HRP-PA-AAP-XAN反應體系的動力學曲線
Fig. 2 Curve of absorbance versus time in reaction systemFig. 3 Kinetic curve of the XOD-HRP-PA-AAP-XAN re反
應條件（
reaction conditions）：T
= 37℃，pH 8.6。action system

反應條件（reaction conditions）：T
= 37℃，pH 8.6。

3. 2. 5根據(jù)米氏常數(shù)選擇黃嘌呤底物濃度分別
以
0. 062、0. 099、0. 308、0. 615和
1.231 mmol /L等不同濃度的黃嘌呤為基質對相同濃度
XOD（49. 3
U/L）的酶活進行測定，觀察底物對酶促反應速度的影響。根據(jù)
Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，線性方
程為（1/ S）= 2. 9619 ×（1/ V）+ 60. 896，相關系數(shù)
r為
0. 9987，求得黃嘌呤氧化酶的米氏常數(shù)為
K=
m

0.049 mmol /L。在酶活測定中，要求底物濃度過量，一般應大于
10倍
Km
值［11］。根據(jù)該實驗結果說明
在本文中采用的
1 mmol / L黃嘌呤作為測定體系的底物濃度是適宜的。
3. 2. 6測定方法的建立首先取
3 mL反應顯色液（pH8. 4）于具塞試管中，加入
100 μL黃嘌呤溶液
（1 mmol / L），在
37℃水浴中預熱
1 min。然后加入
50 μL標準
XOD酶液或發(fā)酵
XOD酶提取液，混勻保溫
20 min，沸水煮
5min終止反應。以不加
XOD反應體系作參比，在
508 nm波長下測定顯色物的吸光度。

3. 3測定方法主要特性
3. 3. 1測定方法的線性范圍將
50 μL標準
XOD酶液（35.51 U /mL）稀釋至
0.55 mL（終濃度為
3. 20
U/ mL），按上述建立的測定方法，用
50 μL微量進樣針分別吸取
5、10、20、30、40、50、60、70、80、90及
100
U / LXOD酶稀釋液加入測定體系。以反應終止后測得的吸光度值為橫坐標，
XOD濃度為縱坐標，繪制
一條標準曲線。結果表明本法所用體系測定
XOD酶活的線性范圍居于5.0～100.0 U /L之間。在此范
圍內的線性回歸方程為：
C
= 299. 21A508 -63. 533，其相關系數(shù)
r
= 0. 9992。根據(jù)純粹與應用化學協(xié)
會（IUPAC）的規(guī)定，計算其檢出限為
1.3 U /L。
3. 3. 2顯色穩(wěn)定性、精密度和回收率實驗將反應終止后的溶液，放置室溫，每隔
10 min測定其吸光
度，考察顯色終止液的穩(wěn)定性。測定結果顯示終止反應后
1h內，該溶液的吸光度數(shù)值沒有明顯的變化。
用已知
50 U /L XOD標準樣品平行測定
10次，測定方法如上所述，平均結果為
49. 7U /L；S=1. 6

s

U/L；RSD = 3.2%。表明用本方法測定
XOD的精密度令人滿意。

按本研究建立的測定方法，在
Arthrobacter
g-X細胞破碎粗提酶液中分別加入
0、20、50、80 U /LXOD

標準酶液，再檢測
XOD酶活單位，每個試樣均測定
5次。測定的回收率均大于
96%，說明該方法用于

測定細菌黃嘌呤氧化酶具有可靠性。

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Determination
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Activity
of
Xanthine
Oxidase
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Horseradish
Peroxidase

Li Zhongqin1，Xu Xiaoping2，Yang Hailin1，Wang Wu#1

1

（The
Key
Laboratory
of
Industry
Biotechnology，Ministry
of
Education，
Southern
Yangtze
University，Wuxi
214036）

2

（College
of
Chemistry
and
Chemical
Engineering，F(xiàn)uzhou
University，F(xiàn)uzhou
350002）

Abstract
A novel technology to determine the activity of xanthine oxidase（
XOD）through the chromogenic
reaction of 4-aminoantipyrine（AAP），phenic acid（PA）and hydrogen peroxide（H2O2），which was produced
via the oxidation of xanthine catalyzed by XOD，under the help of horseradish peroxidase（
HRP）
was
proposed. The influences of temperature、pH and amount of substrate on the activity of XOD were investigated.
The optimal conditions to determine the activity of XOD were obtained as follows：horseradish peroxidase（7000
U/L），4-aminoantipyrine（1 mmol / L），phenic acid（6 mmol / L）and xanthine（1 mmol / L）were dissolved in
50 mmol / L Tris-HCl buffer solution（pH 8.4），the reaction temperature was 37℃，the reaction time was 20
min，the detective wavelength was 508 nm. Under the conditions mentioned above，the linear range of calibrationcurve
wasbetween5.0 U /Land100.0 U /L，and the detection limit was 1. 3 U / L. All these show this
technology is a potential alternative method to determine the activity of XOD in the areas such as laboratory
and clinical diagnosis etc.
Keywords
Xanthine oxidase，horseradish peroxidase，activity determination，spectrophotometry

（
Received 30 August 2005；accepted 5 December 2005 ）

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA