液相色譜基礎知識詳解！

液相色譜是現(xiàn)在食品實驗室中應用非常廣泛的一款儀器，但是還有很多小伙伴對它的原理、使用維護等知識不太了解。今天小編就從HPLC概述、工作原理、結構組成、常見故障及維護、HPLC應用等方面來給大家科普下HPLC的基礎知識。

1 液相色譜法概述

液相色譜法(HPLC)是上個世紀七十年代迅速發(fā)展起來的一項、快速的分析分離技術，是現(xiàn)代分離測試的重要手段。色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobile phase)中的各組分經過固定相時，由于與固定相(station phase)發(fā)生作用(吸附、分配、排阻、親和)的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。

HPLC是在經典的液相色譜法基礎上發(fā)展起來的，其以液體作為流動相，并采用顆粒極細的固定相的柱色譜分離技術。其分離機制與常規(guī)柱色譜相同，但填料更加精細，需高壓泵推動，柱效高，分析速度快。與氣相色譜不同的是液相色譜中流動相亦參與組分的分離過程，其組成、比例和pH值可靈活調節(jié)，分離模式多樣。在實際操作中主要通過改變流動相的組成來調節(jié)樣品在色譜柱的保留值和選擇性，從而使不同樣品得到分離。

液相色譜法自20世紀60年代問世以來，由于使用了高壓輸液泵、全多孔微粒填充柱和高靈敏度檢測器，實現(xiàn)了對樣品的高速、和高靈敏度的分離測定。液相色譜由于吸取了經典液相色譜的研制經驗，并引入微處理機技術，極大的提高了儀器的自動化水平和分析精度?，F(xiàn)在用微處理機控制的液相色譜儀，其自動化程度很高，既能控制儀器的操作參數(shù)(如溶劑梯度洗脫、流動相流量、柱溫、自動進樣、洗脫液收集、檢測器功能等)，又能對獲得的色譜圖進行收縮、放大、疊加，以及對保留數(shù)據(jù)和峰高、峰面積進行處理等，為色譜分析工作者提供了率、功能齊全的分析工具。

液相色譜法的應用范圍十分廣泛，對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，幾乎所有的化合物包括高沸點、極性、離子型化合物和大分子物質均可用液相色譜法分析測定，因而彌補了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20% ，而80% 則需用液相色譜來分析。HPLC因其具有分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度好、能分析和分離高沸點且不能氣化的熱不穩(wěn)定生理活性物質的特點而被廣泛應用于生物化學、藥物及臨床分析，世界各國己將該法收載于藥典。

火焰離子化檢測器、手性、化學發(fā)光、核磁共振、質譜檢測器等新型檢測技術

GC與LC的比較

由于HPLC分析不受溫度和樣品沸點限制，因此具有更廣闊的應用潛力。經過30多年的迅速發(fā)展，液相色譜法在基礎理論、儀器裝置和色譜柱等方面的研究已趨于成熟，現(xiàn)已成為化學化工、環(huán)境、藥學、食品等多個領域中相當有優(yōu)勢的分離分析方法之一。

2 基本原理

液相色譜根據(jù)分離機理的不同可分為：

¬液固吸附色譜

¬液液分配色譜

¬離子交換色譜

¬離子對色譜法

¬分子排阻色譜(或凝膠滲透色譜)

（一）液-固吸附色譜

流動相為液體，固定相為固體吸附劑，根據(jù)物質吸附作用的不同來分離物質。

（二）液-液分配色譜

流動相和固定相都是液體的色譜法即為液-液色譜，是利用樣品組分在兩種不相溶的液相間的分配來進行分離。一種液相為流動相，另一種是涂于載體上的固定相。

流動相極性小于固定相極性的液-液色譜法稱為正相分配色譜法。

流動相極性大于固定相極性的液-液色譜法稱為反相分配色譜法。

（三）離子交換色譜

（四）離子對色譜法

（五）分子排阻色譜法

3 結構組成

（1）泵的基本原理

（2）儀器：四元泵

（3）儀器：手動進樣器——六通閥/定量環(huán)

（4）儀器：自動進樣器

（5）色譜柱：柱溫箱、色譜柱外掛架

（6）儀器：檢測器——紫外

（7）儀器：化學工作站

（8）固定相與流動相

（9）流動相（反相）

4 常見故障及維護

4.1 HPLC對流動相的一般要求

流動相就比如人體的血液，其質量直接影響到整個系統(tǒng)的正常運行與否。

應該使用HPLC級的溶劑，不能互相混溶的溶劑不可以直接切換！一般在水相和與其不混溶的溶劑切換時，使用異丙醇作為過渡溶劑。

注意溶劑的截止波長。截止波長是指該溶劑可以在紫外檢測器中使用的低波長，低于該波長后，溶劑會有很強的紫外吸收，從而影響極限的穩(wěn)定性、干擾對所分析物質的檢測。

HPLC所使用的水必須是新鮮的和經過0.45μm濾膜過濾過的。建議每天更換新鮮的水。長期不用時，必須把使用水的管路用有機溶劑置換，防止長霉。

儀器使用完后要采用適當?shù)娜軇_洗等方法維護色譜柱和系統(tǒng)。如果使用了緩沖鹽一定先將鹽要沖洗干凈。

儀器長期不用時，不建議使用純乙腈封存。因為乙腈有生成聚合物的趨勢。建議使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。

當有流路堵塞時，可以嘗試將之反接后沖洗。污染的溶劑或溶劑瓶里的藻類生長將會縮短溶劑過濾器的使用壽命，并且影響泵和系統(tǒng)的的性能。這在水溶劑或磷酸鹽緩沖液(pH 4 至7) 中尤其如此。

4.1.1 過濾器

•檢查溶劑過濾器

查看過濾器是否變色(尤其是盛放水相的溶劑瓶)–擰開脫氣機出口或比例閥入口管線，此時溶劑會因為重力流出。當脫氣機或溶劑過濾頭堵塞時，溶劑會流出不暢或不流出–臨時取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常。

•清潔溶劑過濾器

將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下，用水沖洗殘留之溶劑，然后將過濾器放在裝有濃硝酸(35％左右)的燒杯里浸一小時。用二次蒸餾水*沖洗過濾器至水為中性可以把過濾器放在塑料燒杯內超聲清洗。但是不可使用玻璃器皿將過濾器重新裝好。

•建議：定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶（可以高溫滅菌），每三個月至少清洗一次。

4.1.2 泵的使用要點

?將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面或較高處。當在四元泵上使用鹽溶液或有機溶劑時，建議將鹽溶液接在下面的梯度閥口上，將有機溶劑接在上面的梯度閥口上，有機溶劑通道在水或鹽溶液通道的正上面。建議用水定期沖洗所有MCGV通道除去可能在閥口析出的鹽結晶。

?操作泵之前，用至少兩個體積（標準脫氣機30mL，對微脫氣機10mL）沖洗真空脫氣機，特別是當泵關閉了一段時間后(例如，過夜)，以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時，防止溶劑瓶內的玻璃濾頭(過濾器)堵塞及長菌，當濾頭表面有黑色或黃色污染層說明發(fā)生了堵塞，應立即清洗或更換。

?定期檢查排液閥的過濾白頭。檢查方法：擰開排液閥，以水作流動相。

對于標準脫氣機(G1322A)，流速5ml/min水，若壓力大于10bar，則建議更換。

對于微量脫氣機(G1379A)，流速2ml/min水，若壓力大于5bar，則建議更換。

?當使用低流速時，檢查所有1/16英寸接頭有無滲漏（用壓力測試或漏液測試。每當更換泵密封墊時排液閥慮芯也應更換。

?更換活塞密封墊時檢查活塞桿上是否有劃痕。有劃痕的活塞將導致輕度滲漏，并降低密封墊的使用壽命。應盡早更換有劃痕的活塞。

?使用緩沖溶液時，關泵前先用水沖洗系統(tǒng)。當需要長時間使 用0.1摩爾或更高濃度的緩沖液時，選用密封墊清洗附件，以減少對密封墊及活塞桿的磨損。

?如果使用了高濃度的緩沖鹽，可以考慮用熱水（50－60℃）來沖洗鹽通道來確保沒有緩沖鹽殘留在系統(tǒng)中。

?更換活塞密封墊后應按照密封墊安裝步驟對其進行磨合，但磨合不適用于正相密封墊。

?當泵頭安裝有柱塞清洗附件時，由于該附件中也有密封墊，這樣就會增加活塞桿運動時的阻力。所以開泵前一定要用10％異丙醇，并將其流速調至約2－3滴/分鐘使溶液流過沖洗裝置。(對于二元泵SL，如果不使用鹽溶液可以不開)10％異丙醇有助于降低水的表面張力，并有抑菌作用。不要用其它溶劑代替。

?當泵頭安裝有沖洗附件而不開啟10％異丙醇，會使密封墊及活塞桿的壽命減短(二元泵SL除外)，泵頭如果發(fā)出“吱吱”聲不影響使用和泵的精度如果有必要，可以改變壓縮因子（compressibility）來達到更好的效果。

4.1.3 自動進樣器

樣品在進樣前必須經過適當?shù)念A先處理，需要經過亞微米濾膜的過濾或者離心，防止樣品中的微小顆粒堵塞管路，使用流動相作為溶劑配制樣品，所用溶劑應該對樣品有較好的溶解性。

針座是喇叭口朝上暴露在空氣中的，有時空氣中的較大灰塵顆?？赡芮『寐湓卺樧牧髀穬榷疳樧亩氯?。這時候可以嘗試卸下針座，將它接在泵的出口上反沖，一般能解決問題。

如果經常使用緩沖溶液，除了泵頭之外，ALS計量泵的柱塞及密封圈，六通閥的轉子密封圈和定子密封圈應該定期清洗，防止有鹽的顆粒磨損ALS一定要使用Agilent的樣品瓶及瓶蓋；使用不兼容的或者加工精度差的樣品瓶及瓶蓋會引起ALS故障率的增加及性能的降低。

4.1.4 DAD常見故障及原因

4.2 HPLC日常維護

4.3 HPLC常見故障診斷

5 HPLC的應用

在環(huán)保方面，HPLC可以應用在：

（1）農藥殘留量分析 ：含氯農藥 、有機磷  農藥 、除蟲菊等；

（2）致癌物質：硝基呋喃及其代謝物、霉素、亞硝胺、苯并芘等；

（3）水質分析：內分泌污染物等；

（4）其它……

在生化方面，HPLC可以應用于：

（1）蛋白質分析；

（2）肽類的分析；

（3）核酸；

（4）氨基酸 ；

（5）其它……