RNA-seq即轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，就是把mRNA，smallRNA，and NONcoding RNA等或者其中一些用高通量測序技術(shù)把它們的序列測出來。反映出它們的表達(dá)水平。

     RNA-seq是一種集合實驗方法和計算機(jī)手段的一種技術(shù)，它可以確定生物樣本中RNA序列的特征性和豐度，也就是說，存在于每條單鏈RNA分子中的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶核糖核酸殘基的組成順序，可以通過RNA測序被識別出來。RNA-seq中的實驗方法涉及從細(xì)胞、組織或整個動物樣本中分離RNA、不同RNA文庫的構(gòu)建、對文庫進(jìn)行化學(xué)法測序以及隨后的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析。同早期的技術(shù)方法相比，例如微陣列，一+個關(guān)鍵區(qū)別在于，當(dāng)前RNA-seq平臺驚人的高通量性和高的靈敏度，使得我們能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本、基因調(diào)控模型和更多非編碼小RNA。

    轉(zhuǎn)錄組是某個物種或者特定細(xì)胞類型產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄本的集合。轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機(jī)理，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。基于Illumina高通量測序平臺的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)使能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進(jìn)行檢測，在分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的同時，還能發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，地識別可變剪切位點以及cSNP（編碼序列單核苷酸多態(tài)性），提供全面的轉(zhuǎn)錄組信息。相對于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺，轉(zhuǎn)錄組測序無需預(yù)先針對已知序列設(shè)計探針，即可對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進(jìn)行檢測，提供更的數(shù)字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強大工具。

    樣品提取總RNA后，對于真核生物，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，對于原核生物，用試劑盒去除rRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片斷成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成cDNA鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I 合成cDNA第二鏈，經(jīng)過試劑盒純化并加 EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個文庫制備工作，構(gòu)建好的文庫用Illumina HiSeq2000進(jìn)行測序。

RNA測序流程包括：

    樣本制備、建庫：總RNA ---> polyA富集mRNA ---> 打斷 ---> 隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA ---> 末端修復(fù)、加A、加接頭

一、RNA樣本采集保存

1、血液RNA保存

    PAXgene® Blood RNA Tube采血管用于采血時細(xì)胞內(nèi)RNA的快速穩(wěn)定。內(nèi)含保護(hù)劑采集后可以快速穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)RNA。室溫穩(wěn)定3天，4℃穩(wěn)定5天。

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     RNAgard Blood Tubes采血管用于血液RNA和DNA的采集、保存和純化。管內(nèi)預(yù)裝保護(hù)劑能快速滲透細(xì)胞膜裂解細(xì)胞，同時穩(wěn)定RNA和DNA免于降解。室溫能保存核酸達(dá)14天，4℃能保存1月。

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血漿游離RNA保存

    CELL-FREE RNA BCT® 采血管用于血漿游離RNA的采集、保存和運送。含有保護(hù)劑穩(wěn)定血漿游離RNA，并能防止血液中其他背景RNA的釋放。室溫下游離RNA能穩(wěn)定7天

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2、組織RNA保存

    RNALater穩(wěn)定液是一種無毒的水溶性組織保存試劑，能夠快速滲入組織內(nèi)部，穩(wěn)定并保護(hù)細(xì)胞RNA。在37°C、25°C和4°C下 RNA 分別可保持穩(wěn)定1天、1周和1個月，-20°C下可長期穩(wěn)定保存。

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二、RNA提取方法-使用試劑盒方法

    富集mRNA，除去rRNA等RNA:依據(jù)為-在測mRNA過程中，首先要去除rRNA。以人為例，在抽提的總RNA中，95%的RNA是rRNA，2%的RNA是mRNA，剩下的則是lncRNA、microRNA、siRNA等。rRNA整個人類當(dāng)中是非常保守的，在各個組織器官中也是非常穩(wěn)定的，因此這些測序結(jié)果對我們的研究是沒有用處的。mRNA則是RNA中比較重要的部分。

    具體：以人的為例：總RNA跟帶有Poly(T)探針的磁珠結(jié)合-洗脫結(jié)合的mRNA-用Mg離子溶液打碎mRNA-隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)條鏈的cDNA，之后再合成第二條cDNA,獲得雙鏈cDNA-對雙鏈cDNA末端修復(fù)，加A加接頭-片段選擇，PCR擴(kuò)增、純化（如果樣本中存在污染物，則需要結(jié)合試劑盒進(jìn)一步純化）。

    一般會在測序前對總RNA進(jìn)行一次質(zhì)檢，根據(jù)電泳質(zhì)檢結(jié)果中的18S和28S（rRNA）兩個峰的高度以及峰的尖度來判斷RNA的質(zhì)量，峰越高越尖（RIN > 8.0）表示RNA的完整度越好。當(dāng)然，濃度以及A260/A280比值也是需要的。

總RNA提取

    TRIzol™ Reagent是一種*的即用型試劑，可用于提取高質(zhì)量的總RNA或者從各種生物樣本中同時提取RNA、DNA和蛋白質(zhì)。這種酚和異硫氰酸胍單相溶液，可用于提取人、動物、植物、酵母或細(xì)菌來源的細(xì)胞和組織樣本中的純RNA、DNA和蛋白質(zhì)，只需一個小時即可完成。

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     GENEzol™ Reagent試劑用于高質(zhì)量總RNA的提取，同時也可提取血液、白膜層、血漿、血清、培養(yǎng)細(xì)胞和組織等多種樣本中RNA、DNA和蛋白質(zhì)。GENEzol是一種酚、三氯甲烷和異硫氰酸胍溶液，是總RNA提取經(jīng)濟(jì)有效的選擇。所提取RNA可直接用于各種下游應(yīng)用，如cDNA 文庫構(gòu)建，克隆，逆轉(zhuǎn)錄PCR，實時PCR，核酸酶保護(hù)分析和Northern印跡雜交。

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     RNeasy Mini Kit 試劑盒可從細(xì)胞、組織或酵母中快速純化高品質(zhì)RNA，硅膠膜RNeasy離心柱的結(jié)合能力達(dá)100 μg RNA。無需酚/三氯甲烷抽提，無需氯化銫梯度離心，無氯化鋰或者乙醇沉淀步驟。數(shù)分鐘內(nèi)快速純化得到高品質(zhì)總RNA，在各種下游應(yīng)用中表現(xiàn)良好。

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單細(xì)胞RNA提取

    ARCTURUS PicoPure RNA 分離試劑盒用于從十個以下細(xì)胞甚至單細(xì)胞中回收高質(zhì)量總RNA。

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去DNA

    Ambion Turbo DNA-free kit 除DNA試劑盒能夠*地消化DNA，并去除消化后的酶和二價陽離子。

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去rRNA

    Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Human/Mouse/Rat)試劑用于從人、小鼠、大鼠樣本中去除細(xì)胞質(zhì)核糖體RNA。

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     RiboMinus Eukaryote Kit 除核糖體RNA

細(xì)菌mRNA提取

    MICROBExpress™ Kit細(xì)菌mRNA富集試劑盒通過從總RNA除去rRNA來提取細(xì)菌mRNA。

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PCR產(chǎn)物純化

    DNA Clean & Concentrator™-5試劑盒用于純化高達(dá)5μg DNA，DNA可來自PCR，核酸內(nèi)切酶消化、DNA修飾、同位素/熒光標(biāo)記等生化反應(yīng)。洗脫DNA適用于PCR、微陣列、連接和測序等。該產(chǎn)品有助于去除DNA聚合酶、修飾酶、RNA聚合酶、連接酶、激酶、核酸酶、磷酸酶和限制性內(nèi)切核酸酶，以及游離dNTP及其類似物，包括放射性標(biāo)記和熒光衍生物。

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磁珠純化

細(xì)胞核分離

    Nuclei EZ Prep細(xì)胞核分離試劑盒用于從哺乳動物細(xì)胞中快速分離胞核。該試劑盒可從通用細(xì)胞類型獲得高得率細(xì)胞核。適合為染色質(zhì)、基因組DNA、組蛋白和核RNA/RNP提供細(xì)胞核來源，為體外凋亡檢測、功能性研究（如細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)檢查）制備細(xì)胞核。

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三、文庫構(gòu)建

     建庫：去除rRNA之后獲得的mRNA進(jìn)行構(gòu)建文庫，先對mRNA打斷再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的文庫構(gòu)建方法。之后反轉(zhuǎn)的cDNA再末端修復(fù)到平末端，加上ployA和接頭

四、測序試劑盒

    測序：SE測序-單端測序；PE測序-雙端測序；一般現(xiàn)在用的是PE測序。

UID轉(zhuǎn)錄組建庫試劑盒

• 省時同時構(gòu)建8個文庫僅5小時，時間節(jié)省30％
• 省力無需第二鏈合成等步聚，操作簡便
• 省心建庫起始量低至100ng
• 測序結(jié)果與qPCR結(jié)果高度一致

 RNA鏈特異性建庫試劑盒

• 省時同時構(gòu)建8個文庫僅5小時，時間節(jié)省30％
• 省力無需第二鏈合成等步聚，操作簡便
• 省心建庫起始量低至100ng

關(guān)于Illuminna、Takara、Rubicon、Kapa等試劑盒詳情請聯(lián)系

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