慢病毒包裝原理、流程和檢測(cè)方法。

一、病毒載體系統(tǒng)

病毒載體介導(dǎo)基因技術(shù)，一種的基因轉(zhuǎn)移工具，將外源基因包裝到天然病毒的外殼中，利用病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染性，將外源基因?qū)胩囟?xì)胞中，廣泛應(yīng)用于基因診斷和基因治療。

二、慢病毒包裝簡(jiǎn)介

病毒有很多種，常見(jiàn)的有慢病毒和腺病毒。慢病毒(Lentivirus)載體是以人類免疫缺陷丨型病毒(HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因載體。

慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，能使外源基因整合入宿主的基因組穩(wěn)定、長(zhǎng)期表達(dá)，比一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒具有更高的滴度和更廣的宿主范圍。攜帶外源基因的慢病毒載體與包裝載體(產(chǎn)生病毒顆粒所需的輔助蛋白)一同轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，即可進(jìn)行病毒的包裝；包裝好的慢病毒為假型病毒（毒感染目的細(xì)胞后不會(huì)再感染其他細(xì)胞，也不會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒，慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代），然后分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)離心取得上清液，再濃縮后的慢病毒液可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。

三、慢病毒載體系統(tǒng)

慢病毒載體系統(tǒng)：包裝成分和載體成分。

產(chǎn)生慢病毒顆粒的輔助成分：慢病毒包裝質(zhì)粒和包裝細(xì)胞系。

慢病毒載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。

慢病毒包裝成分：由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白。包裝成分通常被分開(kāi)構(gòu)建到兩個(gè)質(zhì)粒上，一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Gag和Pol蛋白，另一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Env蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。

將包裝成分與載體成分的3個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞(如人腎293T細(xì)胞)，即可在細(xì)胞上清中收獲只有一次性感染能力而無(wú)復(fù)制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。

四、病毒包裝實(shí)驗(yàn)步驟

1、目的基因真核表達(dá)載體構(gòu)建流程圖

2、質(zhì)粒DNA和其他包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

3、慢病毒感染細(xì)胞

感染步驟：

①鋪板：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化重懸后，按1*105/L密度接種于12孔板，生長(zhǎng)過(guò)夜。

②感染：將70-80%鋪滿12孔板中的培養(yǎng)液吸除，換新鮮的培養(yǎng)液，同時(shí)加入PBS濃度梯度稀釋的病毒液，混合均勻后即可放入孵箱培養(yǎng)。

③24h左右可換液，48小時(shí)即可看熒光，具體根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)來(lái)看。

4、感染后細(xì)胞檢測(cè)方法

蛋白提取及Western檢測(cè)

western-Bloting：蛋白免疫印跡，一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測(cè)三個(gè)部分組成。步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上， 用得多的材料是硝酸纖維素膜(NC 膜)和 PVDF 膜， 蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移 （轉(zhuǎn)移電泳），它又有半干法和濕法之分，現(xiàn)在大多用濕法。第三步是用特異性的抗體檢測(cè)出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相應(yīng)抗原。免疫檢測(cè)的方法可以是直接的和間接的?，F(xiàn)在多用間接免疫酶標(biāo)的方法，在用特異性的抗體雜交結(jié)合后，再用酶標(biāo)的第二抗體（堿性磷酸酶（AP）或辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗抗體的抗體）雜交結(jié)合，再加酶的底物顯色或者通過(guò)膜上的顏色或 X 光底片上暴光的條帶來(lái)顯示抗原的存在。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)中。