上?；菡\生物提供DC細胞培養(yǎng)方案

【背景知識】

DC是“Dendritic Cells”的縮寫，中文全稱為“樹突狀細胞”，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC是由2011年諾貝爾獎獲得者、加拿大籍科學家Ralph M. Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)的，是目前發(fā)現(xiàn)的功能zui強的抗原遞呈細胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已證實，DC是wei一能夠顯著刺激初始T細胞(Naïve T cells)增殖的APC，成熟的DC可以通過Ⅱ型組織相容性抗原（MHC-Ⅱ）等途徑提呈腫瘤抗原，有效抵制腫瘤細胞的免疫逃逸機制，而其它APC(如單核巨噬細胞，B細胞等)僅能刺激已活化的或記憶性的T細胞。DC是機體適應(yīng)性T細胞免疫應(yīng)答的始動者，在腫瘤免疫中具有極其重要的作用。

CIK是單個核細胞在CD3單抗和多種細胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培養(yǎng)獲得的一群以CD3+CD56+細胞為主要效應(yīng)細胞的異質(zhì)細胞群，其既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，又具有NK細胞(自然殺傷細胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。

DC-CIK (或DC+CIK)[1]是指與DC細胞共培養(yǎng)的CIK細胞，也可以說，終的效應(yīng)細胞是經(jīng)DC體外活化的CIK細胞。多項研究表明，DC與CIK具有協(xié)同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表達及抗原遞呈能力均明顯提高，而CIK的增殖能力和體內(nèi)外細胞毒活性也得以增強，因此DC-CIK較單獨的CIK治療更為有效。若將腫瘤抗原負載的DC與CIK共培養(yǎng)，可刺激產(chǎn)生腫瘤抗原特異性的T細胞，這樣的DC-CIK治療則兼具特異性和非特異性雙重腫瘤殺傷作用，比未負載腫瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更強，常被用于臨床和科研。

CIK細胞和DC細胞是細胞免疫治療的2個重要組成部分，兩者聯(lián)合可確保高效的免疫反應(yīng)。

【培養(yǎng)原理】

1．DC培養(yǎng)用細胞因子：

1.1 GM-CSF(粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子)

GM-CSF是一種造血生長因子，在體外可刺激中性粒細胞和巨噬細胞的集落形成，并具有促進早期紅巨核細胞、嗜酸性祖細胞增殖和發(fā)育的功能。

GM-CSF是早被鑒定出來對于DC有作用的細胞因子之一。GM-CSF在DC培養(yǎng)中的功能是促進單核細胞向大巨噬樣細胞分化，細胞表面MHC II類分子的表達得以提高，從而增強細胞的抗原遞呈功能。此外，GM-CSF還可促進DC的存活。

1.2 IL-4 (白細胞介素-4)

IL-4在由單核細胞誘導成DC的過程中發(fā)揮的作用是抑制巨噬細胞的過度生長，從而引導單核細胞向DC方向分化。若培養(yǎng)體系中不加IL-4，單核細胞將分化為巨噬細胞。同時，IL-4還有降低細胞表面表達CD14分子的能力。CD14表達水平的降低是單核細胞分化為DC的重要標志。

GM-CSF和IL-4共同作用可使單核細胞定向分化為未成熟DC(immature DC)，此時的DC具有較強的抗原攝取和加工能力，但抗原遞呈能力很弱。細胞表面中度表達MHC I類、II類分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，但不表達CD14。

1.3 TNF-α (腫瘤壞死因子-α)

TNF-α可下調(diào)未成熟DC的巨胞飲作用和表面Fc受體的表達，使細胞內(nèi)MHC II類分子區(qū)室(class II compartment)消失，但能夠上調(diào)細胞表面 MHC I類、II類分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表達，使未成熟DC分化為成熟DC(mature DC)，此時DC的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強，可*的激活T細胞。

【細胞制備】

1．外周血單個核細胞的采集

1.1用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞80-100mL；

1.2淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC)；

1.3無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的 PBMC，細胞數(shù)量需達到1-3x10⁸。 

2. DC 細胞的培養(yǎng)及鑒定

2.1 步驟1中獲得的PBMC用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至2 x 10^6/ml，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)；

2.2 37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育2h，以使單核細胞貼壁；

2.3 吸去懸浮的細胞，剩下的貼壁細胞(主要是 CD14+的單核細胞)，加入含重組人GM-CSF 500-1,000U/ml和重組人IL-4 500U/ml的無血清培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導單核細胞向DC細胞分化；

3.2 每3d半量換液一次，并補足細胞因子；

3.3在培養(yǎng)的第6d，加入重組人TNF-a(500U/ml)，誘導DC細胞成熟；

3.4在培養(yǎng)的第7d或第8d，收獲DC細胞，其數(shù)量應(yīng)達到1×10^6個以上；

3.5 DC的質(zhì)檢：

3.5.1 臺盼藍染色檢測細胞活力：活細胞應(yīng)在80%以上；

3.5.2 流式細胞儀檢測DC細胞表面HLA-DR、CD83和CD86等分子的表達，以確定DC 是否成熟。

4.收獲細胞前，取少量培養(yǎng)物進行細菌、真菌培養(yǎng)，并檢測支原體、衣原體，及內(nèi)毒素(標準：病原學檢測陰性，內(nèi)毒素<5 Eu)。

【推薦試劑】

【其它相關(guān)試劑】