NGS液體活檢診斷病原感染

病原微生物的檢測是感染類疾病的診斷治療中*的重要環(huán)節(jié)。

      傳統(tǒng)的病原微生物檢測方法分為培養(yǎng)和非培養(yǎng)兩類，臨床*的金標(biāo)準(zhǔn)是分離培養(yǎng)和生化鑒定，這種方法的操作周期長、失敗率高，并且不是每種病原體都可以培養(yǎng)。相比之下，不依賴培養(yǎng)的鏡檢、抗體抗原免疫等方法，在采樣當(dāng)天即可報告結(jié)果。這些方法的時效性強(qiáng)，但在準(zhǔn)確性上存在明顯劣勢。

      近年來，基于核酸檢測的分子診斷技術(shù)發(fā)展迅速?；?span style="font-family:helvetica neue">PCR的方法直接從樣本中識別微生物可以加速鑒定，但這些測試僅包括少量病原體，在選擇測試之前需要進(jìn)行推定診斷，仍然不能滿足的臨床需要。

然而，大量的重癥感染病例由于不能得到及時的診斷和治療而延誤病情，造成不可挽回的嚴(yán)重后果。如何才能實現(xiàn)快速，高效，精準(zhǔn)，無創(chuàng)，廣譜定性的病原檢測已成為臨床醫(yī)學(xué)追求的目標(biāo)。

      cfDNA檢測技術(shù)讓這一希望得以實現(xiàn)：這種非侵入性診斷技術(shù)目前在在胎兒異常診斷、移植器官排異檢測及癌癥的表征及檢測中已得到大量應(yīng)用，而在病原感染檢測中，cfDNA檢測技術(shù)可以實現(xiàn)血漿中不同位置感染的病原體DNA的片段檢測，實現(xiàn)無創(chuàng)檢測多種感染的可能。

      膿毒癥，一種因感染導(dǎo)致組織和器官損傷，進(jìn)而造成的全身性炎癥反應(yīng)。每年有近3000萬人會感染此類疾病，其中超過1800萬為嚴(yán)重病例，800萬人會因此喪生。早期的發(fā)現(xiàn)和適當(dāng)?shù)闹委熢谀摱景Y預(yù)防和控制方面意義重大。

   2019年，著名學(xué)術(shù)期刊《Nature microbiology》報道了一例利用cfDNA技術(shù)檢測膿毒癥病原的實例，工作流程如下圖：

     基于此技術(shù)，病原微生物的臨床可報告范圍（CRR）有了極大拓展，可包括（1）DNA病毒，可培養(yǎng)細(xì)菌，其他條件苛刻和不可培養(yǎng)的細(xì)菌，分枝桿菌，文獻(xiàn)中的真核病原體；（2）在已發(fā)表的病例報告中引用的病原體數(shù)據(jù)庫；（3）從臨床分離測序獲得的參考基因組以及已報道的致病性病原。

     這其中，快速精準(zhǔn)以及低微核酸起始量（10pg-100ng）的測序文庫構(gòu)建，得益于Tecan*的Ovation Ultralow Library System V2 文庫構(gòu)建技術(shù)，該技術(shù)廣泛適用于各種類型的核酸樣本建庫，尤其在面對cfDNA檢測的超低起始量時表現(xiàn)良好，并能在3小時內(nèi)完成簡單，自動化的建庫過程，并能應(yīng)對各種GC含量的高保真擴(kuò)增。技術(shù)路線如下：

Ovation Ultralow Library System V2可應(yīng)用于各種類型的測序研究，包括：全基因組測序、外顯子測序、ChIP-seq、微生物組研究，液態(tài)活檢，石蠟包埋樣本（FFPE）等。建庫過程中不會產(chǎn)生接頭二聚體（見下圖，與競品的比較）。

效果穩(wěn)定，不受核酸起始量影響：

在GC含量的樣本中也能有穩(wěn)定出色的表現(xiàn)：

在《Nature microbiology》的膿毒癥cfDNA病原檢測研究中，Ovation Ultralow Library System V2大放異彩。研究中利用350名敗血癥患者，166份未發(fā)現(xiàn)明確膿毒癥的樣本開展cfDNA的提取，運用二代測序檢測技術(shù)，鑒別并定量血液中1250種與臨床相關(guān)的細(xì)菌、DNA病毒、真菌和真核寄生蟲，可利用血液中游離微生物DNA（cfDNA），準(zhǔn)確、快速地診斷多種感染。

研究中的cfDNA病原微生物檢測，可以實現(xiàn)高度敏感（靈敏度LoD &小檢測量 LoQ）的病原微生物檢測,廣譜病原檢測可報告范圍使cfDNA病原檢測技術(shù)具有更廣泛的敏感性：在不用含量血漿DNA檢測中均有出色表現(xiàn)，結(jié)合臨床驗證，125次模擬中有121次正確檢測，靈敏度達(dá)97%：陽性預(yù)a-c測值（Ppv）達(dá)99%，與預(yù)測的95%高度一致（圖a-c）；

      該技術(shù)可實現(xiàn)病原的精準(zhǔn)檢測，在實驗?zāi)Ｐ椭羞M(jìn)行檢測精準(zhǔn)度研究發(fā)現(xiàn)，快速檢驗測試中的重復(fù)測量，個體微生物的平均變異系數(shù)為21.1%（±13.6%），與實驗室內(nèi)的檢測精密度相當(dāng)。

      由于個體間cfDNA中病原成分的差異，在使用臨床樣本時難以準(zhǔn)確區(qū)分cfDNA中低水平存在的環(huán)境污染DNA。所以研究利用重復(fù)測量評估了這種方法檢測的分析特異性（下圖）。在被測試的50件復(fù)制品中，意外的微生物cfDNA僅在一次復(fù)制中檢出，總特異性為98%；以不同比例混入混入菌株檢測，檢測值與預(yù)期也保有良好一致性，同時證實了密切相關(guān)物種共感染造成的干擾極低。

     為了評價血漿來源的微生物cfdna作為廣泛感染病原體的生物標(biāo)志物的有效性，研究亦將微生物cfDNA測序結(jié)果與病原體鑒定結(jié)果進(jìn)行了比較（下圖）。與原血培養(yǎng)相比，cfDNA技術(shù)敏感度可達(dá)93.7%，同時cfDNA技術(shù)提供了物種級鑒定的靈敏度和速度。

       血液游離微生物DNA測序，有望作為非侵入性檢測方法用于感染疾病檢測。而快速高效高靈敏精準(zhǔn)的建庫技術(shù)則是臨床病原體檢測診斷的核心。Ovation Ultralow Library System V2技術(shù)，完美將快速建庫，低核酸起始量背景，高精準(zhǔn)測量要求整合，滿足了多種研究和樣本類型的建庫要求，為科學(xué)研究及臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

Analytical and clinical validation of a microbial cell-free DNA sequencing test for infectious disease. Nature microbiology,2019.