宏轉(zhuǎn)錄組用于監(jiān)測(cè)蟲(chóng)媒病毒的研究

宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)（總RNA測(cè)序）可實(shí)現(xiàn)樣品中病毒的非靶向，高通量檢測(cè)和鑒定。它可以用于檢測(cè)已知病毒和新型病毒，同時(shí)提供完整的基因組信息，使其成為功能強(qiáng)大的監(jiān)測(cè)工具。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)已用于多種監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，包括檢測(cè)人類(lèi)污水中的病毒，監(jiān)測(cè)無(wú)脊椎動(dòng)物中間宿主（例如蜱）和脊椎動(dòng)物中間宿主（如蝙蝠）中的病毒，以及在爆發(fā)期間溯源病毒株。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)在一系列監(jiān)測(cè)應(yīng)用中的成功應(yīng)用表明它具有提高當(dāng)前蟲(chóng)媒病毒（節(jié)肢動(dòng)物傳播的病毒）監(jiān)測(cè)程序的潛力。

蟲(chóng)媒病毒對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康構(gòu)成重大威脅，其中包括登革熱，黃熱病，寨卡病毒，基孔肯雅熱，藍(lán)舌病和馬腦炎病毒等病原體，僅登革熱病毒每年就感染約3.9億人。病毒監(jiān)測(cè)可作為增加傳播風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)警系統(tǒng)，并采用諸如誘捕蚊子，在細(xì)胞培養(yǎng)中分離病毒以及使用定量PCR（qPCR）分析進(jìn)行靶向分子病毒檢測(cè)等手段。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一種非靶向方法，為蟲(chóng)媒病毒監(jiān)測(cè)提供了許多優(yōu)勢(shì)。它可以在不進(jìn)行培養(yǎng)的情況下檢測(cè)病毒，不需要先確定病毒序列，可以識(shí)別新的蟲(chóng)媒病毒威脅，闡明混合感染，并可以為暴發(fā)的分子流行病學(xué)調(diào)查提供完整的基因組序列或特定的蛋白質(zhì)序列。此外，它可以檢測(cè)蚊子群中的其他生物，包括共生菌和寄生蟲(chóng)（如利什曼原蟲(chóng)）。

為了將轉(zhuǎn)錄組學(xué)用于蟲(chóng)媒病毒監(jiān)測(cè)，必須首先認(rèn)證監(jiān)測(cè)蚊子群方法的敏感性和特異性。許多研究已經(jīng)使用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法通過(guò)Illumina，Ion Torrent和Oxford Nanopore測(cè)序來(lái)檢測(cè)單個(gè)蚊子中的病毒。更多的研究是對(duì)蚊子群體進(jìn)行測(cè)序，群體的樣本數(shù)從5個(gè)到6700個(gè)標(biāo)本不等。這些研究主要集中在探索各種蚊子種群中存在的病毒多樣性。但是，大量蚊子用于蟲(chóng)媒病毒監(jiān)測(cè)時(shí)，缺乏有關(guān)宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試指標(biāo)（例如敏感性和特異性）的研究。在評(píng)估傳播風(fēng)險(xiǎn)和了解病毒豐度的時(shí)間變化時(shí)，這一點(diǎn)至關(guān)重要。病毒載量和測(cè)序結(jié)果之間的關(guān)系需要明確，以避免對(duì)序列數(shù)據(jù)的錯(cuò)誤解讀，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果（檢測(cè)到蚊子群中不存在病毒）和蚊子群中存在的病毒的假陰性結(jié)果（檢測(cè)失敗）。

實(shí)驗(yàn)室工作流程會(huì)大大影響宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)蚊子中蟲(chóng)媒病毒的能力。一種提高靈敏度的流行方法是使用過(guò)濾，PEG沉淀或不依賴(lài)序列的擴(kuò)增方法來(lái)富集蟲(chóng)媒病毒。盡管這確實(shí)增加了病毒序列的數(shù)量，但富集也會(huì)引入偏向bias。增加病毒序列數(shù)量的另一種方法是消耗蚊子RNA，通常是靶向豐富的核糖體RNA（rRNA）去除。有多種rRNA去除試劑盒可采購(gòu)，但是這些試劑盒并非特定于蚊子的，因此需要采用基于蚊子rRNA序列的定制探針。

來(lái)自澳大利亞的科學(xué)家采用Nugen的蚊媒RNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（特異性去除蚊子rRNA探針）驗(yàn)證了高通量基因測(cè)序（NGS）技術(shù)蚊子中蟲(chóng)媒病毒的敏感性和特異性。為了對(duì)此進(jìn)行評(píng)估，將羅斯河病毒（RRV）和Umatilla病毒（UMAV）分離株的五種稀釋度（1：1、1：20、1：400、1：8,000和1：160,000）摻入100個(gè)樣本群的子樣本中南方庫(kù)蚊（Culex australicus）蚊子。 1：1稀釋表示100只蚊子池中一只RRV感染的蚊子的病毒載量?？茖W(xué)家對(duì)子樣本進(jìn)行了核酸提取，蚊子特異性核糖體RNA去除和Illumina HiSeq測(cè)序。科學(xué)家還使用數(shù)字PCR（RT-ddPCR）和定量PCR（RT-qPCR）測(cè)量了子樣品的病毒載量。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在1：1、1：20和1：400子樣本中檢測(cè)到RRV和UMAV。正確識(shí)別了100％的RRV和99.6％的UMAV組裝序列，實(shí)現(xiàn)了高特異性。宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序不如RT-qPCR或RT-ddPCR靈敏，但是它得到了全基因組序列并檢測(cè)到其他19種病毒，其中包括澳大利亞的四次*發(fā)現(xiàn)的病毒。這些發(fā)現(xiàn)將有助于蟲(chóng)媒病毒監(jiān)測(cè)計(jì)劃在常規(guī)監(jiān)測(cè)活動(dòng)中利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)來(lái)加強(qiáng)蟲(chóng)媒病毒的檢測(cè)。

之后，澳大利亞科學(xué)家采用這種方法在蚊子中發(fā)現(xiàn)了Yada病毒。