水質(zhì)急性毒性測(cè)定發(fā)光細(xì)菌國(guó)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

水質(zhì)急性毒性的測(cè)定發(fā)光細(xì)菌法

深圳耐思特科學(xué)儀器有限公司是一家專主于研發(fā)水質(zhì)急性綜合生物毒性在線監(jiān)測(cè)儀器的高X技術(shù)企業(yè)，由公司自主研發(fā)的生物毒性水質(zhì)自動(dòng)在線預(yù)警系統(tǒng)在行業(yè)內(nèi)*提出生物綜合毒性“定量與定性”結(jié)合的概念，使儀器智能化、物聯(lián)網(wǎng)的概念，針對(duì)具體的應(yīng)用形成對(duì)應(yīng)的解決方案與服務(wù)。欲了解更多詳情請(qǐng)搜索深圳耐思特科學(xué)儀器進(jìn)入網(wǎng)站。

1主題內(nèi)容與適用范圍

1.1主題內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定水環(huán)境急性毒性的發(fā)光細(xì)菌法。

1.2適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)適用于工業(yè)廢水、納污水體及實(shí)驗(yàn)室條件下可溶性化學(xué)物質(zhì)的水質(zhì)急性毒性監(jiān)測(cè)。

2方法提要

基于發(fā)光細(xì)菌相對(duì)發(fā)光度與水祥毒性組分總濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（PW0. 05）,因苗可通過生物發(fā)光 光度計(jì)測(cè)定水樣的相對(duì)發(fā)光度,以此表示其急性毒性水平。

水質(zhì)急性毒性水平按8所述條件選用相當(dāng)?shù)膮⒈榷疚?/span>綠化汞濃度（以mg/L為單位）來表征，或選 用EC'。值（半數(shù)有效濃度一-以樣品液百分濃度為單位）來表征。

3試劑和材料

本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑除另有說明外,均應(yīng)為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭⒄糁邓蛲燃兌鹊乃?/span>

3.1綠化汞HgCl2.

3.2Y化鈉NaCl,化學(xué)純。

3.3明亮發(fā)光桿菌T3小種（Photobacterium phosphoreum T3 spp.）凍干粉，安甑瓶包裝，每瓶0. 5g,在 2?5C冰箱內(nèi)有效保存期為6個(gè)月.新制備的發(fā)光細(xì)菌休眠細(xì)胞（凍干粉）密度不低于每克800萬個(gè)細(xì) 胞;當(dāng)按6. 2. 4步驟將凍干粉復(fù)蘇2 min后即發(fā)光（可在暗室內(nèi)檢驗(yàn)，肉眼應(yīng)見微光），稀釋成工作液后 每毫升菌液不低于1- 6萬個(gè)細(xì)胞（5 ml測(cè)試管）或2萬個(gè)細(xì)胞（2 ml測(cè)試管）（均為稀釋平板法測(cè)定）。在 毒性測(cè)試儀上測(cè)出的初始發(fā)光量應(yīng)在600-1 900 mV之間，低于600 mV允許將倍率調(diào)至“X2”檔，高 于1900 mV允許將倍率調(diào)至“X0. 5”檔。仍達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)者,更換凍干粉。

3.4L化鈉溶液,3g/100 mL

氧化鈉3 g于玻璃容器內(nèi)，用量筒加蒸慵水100 ml。

3.5氧化鈉溶液,2g/100mL

氧化鈉2 g,加蒸儲(chǔ)水100 ml,于試劑瓶?jī)?nèi)，2?5C保存。

3.6參比毒物綠化汞標(biāo)準(zhǔn)溶液。

0. 02,0. 04,0. 06,0. 08,0.10,0.12,0.14,0. 16,0.18,0. 20,0. 22,0, 24 mg/L。

3.7 Y化汞母液,p=2 000 mg/L。

萬分之一分析天平精稱密封保存良好的無結(jié)晶水綠化汞0. 100 0 g入50 ml容量瓶，用3g/100 ml 氯化鈉溶液稀釋至刻度，置2?5C冰箱備用，保存期6個(gè)月。

國(guó)家*1995-03-25批準(zhǔn) "~1995-08-01實(shí)施

GB/T 15441-1995

3- 8Y化汞工作液,*=2 mg/L。

用移液管吸綠化汞2 000 mg/L母液10 ml入1 000 ml容量瓶，用3 g/100 ml氧化鈉溶液定容。再 用移液管吸取綠化汞20 mg/L液25 ml入250 ml容量瓶，用3 g/100 ml氧化鈉溶液定容，將此液倒入 ,配有半微量滴定管的試液瓶，然后，用3 g/100 ml氯化鈉溶液將疑化汞2 mg/L溶液按表1稀釋成系列 濃度（一律采用50 ml容量瓶）。這些Y化汞稀釋液保存期不超過24 h,超過者務(wù)必重配。

表1綠化汞工作溶液稀釋配制系列（在50 ml容量瓶中）

加綠化汞（2 mg/L）數(shù),ml 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0

稀釋定容后綠化汞濃度,mg/L 0.02 0.04 0.06 0.08 0. 10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 0.22 0.24

4儀8S

4.1生物發(fā)光光度計(jì)。

配置2或5 ml測(cè)試管。

當(dāng)果;化汞標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.10 mg/L時(shí)，發(fā)光細(xì)菌的相對(duì)發(fā)光度為50%，其誤差不超過士 10% o

4.2 2 ml或5 ml測(cè)試樣品管（具標(biāo)準(zhǔn)磨口塞,為制造比色管的玻璃料制作，由專業(yè)玻璃儀器廠制造）， 分別適用于相應(yīng)型號(hào)的生物發(fā)光光度計(jì)。

4.3微量注射器；10

4.4注射器：lml0

4.5定量加液瓶：5ml。

4.6 吸管：2、10、25mL

4 7試劑瓶:100 ml。

4.8 量筒：100、500 ml。

4.9 棕色容量瓶：50、250、1 000 ml。

4.10半微量滴定管（配磨口試液瓶,全套儀器均為棕色）:10 ml。

5樣品

5.1樣品的采集和保存

a.采樣瓶使用帶有聚四氯乙烯襯墊的玻璃瓶，務(wù)必清潔、干燥。采集水樣時(shí)，瓶?jī)?nèi)應(yīng)充滿水樣不留 空氣。采樣后，用塑膠帶將瓶口密封。

b.毒性測(cè)定應(yīng)在采樣后6 h內(nèi)進(jìn)行。否則應(yīng)在2?5C下保存樣品，但不得超過24 h。報(bào)告中應(yīng)寫 明水樣采集時(shí)間和測(cè)定時(shí)間。

c.對(duì)于含固體懸浮物的樣品須高心或過濾去除，以免干擾測(cè)定。

5.2樣品液的稀釋

5.2.1樣品液測(cè)定前稀釋的條件

5.2.1.1樣品液預(yù)試驗(yàn) 取事先加瓠化鈉至3 g/100 ml濃度的樣品母液2 ml裝入樣品管，并設(shè)一支 CK管（氧化鈉3 g/100 ml溶液），按6所述測(cè)定相對(duì)發(fā)光度。

5.2.1.2按5.2.1.1測(cè)得的樣品，相對(duì)發(fā)光度低于50%乃至零，欲以EC”表達(dá)結(jié)果，則須稀釋。

5.2.13按5. 2.1.1測(cè)得的樣品,相對(duì)發(fā)光度在1%以上,欲以與相對(duì)發(fā)光度相當(dāng)?shù)囊苫瘽舛缺磉_(dá) 結(jié)果,則不須稀釋。

5.2.2樣品液的稀釋液

樣品液的稀釋液一律用蒸懈水，在定容前一律按構(gòu)成氧化鈉3 g/100 ml濃度添加氯化鈉或濃溶液 （母液只能加固體）。

5.2.3樣品液稀釋濃度的選擇

GB/T 1 5441-1 995

5. 2.3.1探測(cè)試駛

按對(duì)數(shù)系列將樣品液稀釋成5個(gè)濃度：100%、10%、1%、。.1%、0.01%（它們的對(duì)數(shù)依次為。,一1， 一2, — 3, — 4）,按6所述粗測(cè)-遍視1%?100%相對(duì)發(fā)光度落在哪一濃度范圍。

5?2.3.2試驗(yàn)

在1%?100%相對(duì)發(fā)光度所落在的濃度范圍內(nèi)再增配6?9個(gè)濃度（例如，若落在0. 1%?10%之 間，則應(yīng)稀釋成。.l%、0. 25%、0.5%、0. 75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%;若落在 1%?10%之間，則 應(yīng)稀釋成1%、2%、4%、6%、8%、10%）,按6所述再測(cè)一遍;這6?9個(gè)濃度，也可通過查對(duì)數(shù)表，按等 對(duì)數(shù)間距原則自行確定（例如，若落在1%?10%之間，則應(yīng)稀釋成10%、6. 31%、3. 98%、2. 51%, 1. 58%、1. 00%,它們的對(duì)數(shù)相應(yīng)為 1. 00.0. 80,0. 60,0. 40.0. 20.0. 00,對(duì)數(shù)間距均為 0. 2）。

6測(cè)定

6-1測(cè)定條件

6.1.1室溫

室溫20?25C。

同一批樣品在測(cè)定過程中要求溫度波動(dòng)不超過±「C °且所有測(cè)試器皿及試劑、溶液測(cè)前1 h均置 于控溫的測(cè)試室內(nèi)。

6-1-2 pH

若須測(cè)定包括pH影響在內(nèi)的急性毒性，不應(yīng)調(diào)節(jié)水樣pH。

若須測(cè)定排除pH影響在內(nèi)的急性毒性，須將水樣和CK（氯化鈉3 g/100 ml）pH測(cè)前調(diào)至下值:主 要含Cu水樣為4. 5,主要含其他金屬水樣為5. 4,主要含有機(jī)化合物水樣為7. 0。

6.1.3溶解氧

本法只能測(cè)定包括溶解氧影響在內(nèi)的急性毒性。

6-2測(cè)定步驟

6.2.1試管的排列

于塑料或鐵制試管架上按以下二種情況排列測(cè)試管。

6.2.1.1按5. 2.1.3所述，樣品母液相對(duì)發(fā)光度為1%以上者，如下排列：

左側(cè)放參比毒物綠化汞系列濃度溶液管，右側(cè)放樣品管。前排放綠化汞溶液和樣品管，后一排放對(duì) 照（CK）管，后二排放CK預(yù)試驗(yàn)管。每管綠化汞或樣品液均配一管CK（氧化鈉3 g/100 ml蒸饞水溶 液）。設(shè)3次重復(fù)。每測(cè)一批樣品，均須同時(shí)配置測(cè)定系列濃度綠化汞標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表2試管在試管架上的排列

后二排 CK* CKg2

后一排 CK CK CK CK CK CK …CK CK CK CK CK CK CK …CK

前排 0.02 0.02 0.02 0.04 0.04 0.04 … 0.24 樣】棒1樣1祥2樣2祥2…樣”

管群 綠化汞（mg/L〉 樣 品

6. 2-1.2按5. 2.1. 2所述，樣品母液相對(duì)發(fā)光度為50%以下乃至零者，如下排列：

左側(cè)僅放Y化汞0. 10 mg/L溶液管（作為檢驗(yàn)發(fā)光細(xì)菌活性是否正常的參考毒物濃度，它反應(yīng) 15 min的相對(duì)發(fā)光度應(yīng)在50%左右），右側(cè)放樣品稀釋液管（從低濃度到高濃度依次排列）。其他同 6. 2. L 1。每測(cè)一批樣品，均須同時(shí)配測(cè)綠化汞0. 10 mg/L溶液。

6.2-2加3 g/100 ml M化鈉溶液

用5 ml的定量加液瓶給每支CK管加2或5 ml兼化鈉3 g/100 ml（據(jù)儀器型號(hào)而定）。

6.2.3 加樣品液

GB/T 15441-1995

用2或5 ml吸管給每支樣品管加2或5 ml樣品液（據(jù)6.2.2而定）。每個(gè)樣品號(hào)換■支吸管。 6.2.4發(fā)光細(xì)菌凍干菌劑復(fù)蘇

從冰箱2?5 C室取出含有0.5 g發(fā)光細(xì)菌凍干粉的安甑瓶和氯化鈉溶液，投入置有冰塊的小號(hào) （1?1. 5 L）保溫瓶，用1 ml注射器吸取0. 5 ml冷的氯化鈉2 g/100 ml（適用于5 ml測(cè)試管）或1 ml冷 的氯化鈉2. 5%（適用于2 ml測(cè)試管）注入已開口的凍干粉安甑瓶，務(wù)必充分混勻。2min后菌即復(fù)蘇圜 光（可在暗室內(nèi)檢驗(yàn)，肉眼應(yīng)見微光）。備用。

6.2.5儀器的預(yù)熱和調(diào)零

打開生物發(fā)光光度計(jì)電源，預(yù)熱15 min,調(diào)零,備用。

6.2-6儀器檢驗(yàn)復(fù)蘇發(fā)光細(xì)菌凍干粉質(zhì)量

另取一空2或5 ml測(cè)試管，加2或5 ml氯化鈉3 g/100 ml（據(jù)6. 2. 2而定），加10』復(fù)蘇發(fā)光菌 液，蓋上瓶塞，用手斯倒5次以達(dá)均勻。拔去瓶塞,將該管放入各自型號(hào)儀器測(cè)試艙內(nèi)，若發(fā)光量立即顯 示（或經(jīng)過5?10 min上升到）60qfmV以上，此瓶?jī)龈煞劭捎糜跍y(cè)試，低于者按3.1. 4處理。菌液發(fā)光量 先緩慢上升,約持續(xù)5?15 min,后緩慢下降,約持續(xù)4 h。滿4 h的CK發(fā)光量應(yīng)不低于400 mV,低于者 更換凍干粉。

6.2.7給各測(cè)試管加復(fù)蘇菌液

在發(fā)光菌液復(fù)蘇穩(wěn)定（約半小時(shí)）后，按6. 2所述，從左到右,按綠化汞或樣品管（前）一CK管（后） 一綠化汞或樣品管（前）一CK管（后）……順序，用10貝微量注射器（勿用定量加液器以減少誤差）準(zhǔn)確 吸取10 R復(fù)蘇菌液,逐一加入各管，蓋上瓶塞，用手顛倒5次，拔去瓶塞,放回原位（每管加菌液間隔時(shí) 間勿短于30 s°每管在加菌液的當(dāng)時(shí)務(wù)必精確計(jì)時(shí),記錄到秒，即為樣品與發(fā)光菌反應(yīng)起始時(shí)間°立即將 此時(shí)間加殖重,記作各管反應(yīng)終止（也即應(yīng)該讀發(fā)光量）的時(shí)間。

6.2.8發(fā)光細(xì)菌與樣品反應(yīng)達(dá)到終止時(shí)間的讀數(shù)

按各管原來加菌液的先后順序，當(dāng)某管達(dá)到記錄的反應(yīng)終止時(shí)間，在不加瓶塞的情況下，立即將測(cè) 試管放入儀器測(cè)試艙，讀出其發(fā)光量（以光信號(hào)轉(zhuǎn)化的電信號(hào)——電壓mV數(shù)表示）。

6.2.9有色樣品測(cè)定干擾的校正

a.拿掉儀器樣品船上的黑色塑料管口 ；

b.取一 2 ml測(cè)試管（直徑12 mm），加氯化鈉3 g/100 ml溶液2 ml,將該管放進(jìn)一裝有少量氧化 鈉3 g/100 ml溶液的5 ml管（直徑20 mm）內(nèi)，要使外管與內(nèi)管的氯化鈉3 g/100 ml液面平齊。此作CK 管，

c.另取一 2 ml測(cè)試管，加氯化鈉3 g/100 ml溶液2 ml,放入另一裝有少量有色待測(cè)樣品液的 5 ml管內(nèi)，要使外管與內(nèi)管的氧化鈉3 g/100 ml液面平齊。此作CKc管*

d.于CK和CKc二管的內(nèi)管中同時(shí)加復(fù)蘇發(fā)光菌液10 "1（注意:必須是本批樣品測(cè)定所用同一 瓶篡蘇菌液），立即記時(shí)到秒，等反應(yīng)滿15 min,迅即放入儀器測(cè)試艙，測(cè)定二只帶有內(nèi)管的5 ml測(cè)試管 的發(fā)光量。分別記下發(fā)光量京CK管）和乙2（CKc管）；

e.計(jì)算因顏色引起的發(fā)光量（mV）校正值

f.按6. 2.7和6. 2. 8所述常規(guī)步驟測(cè)試帶色樣品管及其CK管（氯化鈉3 g/100 ml溶液）的發(fā)光 量（mV）。所有CK管測(cè)得之發(fā)光#（mV）均須減去校正值乂（mV）后才能作為CK發(fā)光量（mV）。

GB/T 15441-1995

圖1有色樣品溶液測(cè)定干擾的校正

7測(cè)試結(jié)果的春達(dá)

7-1計(jì)算樣品相對(duì)發(fā)光度（％），并算出平均值。

相對(duì)發(fā)光度（%）=氧化噬碧齡寂時(shí)）x 100 （ 1）

相對(duì)發(fā)光度（％）平均值=（重復(fù)以^%）+（重復(fù);）（％）+（重復(fù)3）（%）……（2）

7. 2符合5. 2.1.3條件者，建立并檢驗(yàn)綠化汞濃度（C）與其相對(duì)發(fā)光度（『）％均值的相關(guān)方程,也可以 繪制關(guān)系曲線。

».求出一元一次線性回歸方程的a（截距）0（斜率、回歸系數(shù)）和「（相關(guān)系數(shù)），列出方程」

T ~ a-\- V■化秉  （ 3 ）

查相關(guān)系數(shù)顯著水平（P值）表，檢驗(yàn)所求，值的顯著水平。若-W0. 01,且EG。皿秉=0. 10 ±0. 02mg/L,則所求相關(guān)方程成立;反之，不能成立，須重測(cè)系列甄化汞濃度的發(fā)光景.綠化汞溶液配 制過夜者，須重配后再測(cè)定。

b.也可以據(jù)建立的上述方程繪制關(guān)系曲線。即發(fā)光度為10%和90%，代入上式，求出相應(yīng)的 二個(gè)林化汞濃度，在常數(shù)坐標(biāo)紙上，定出二點(diǎn)，畫一直線,即為符合該方程的巍化汞濃度與相對(duì)發(fā)光度的 關(guān)系曲線。

7. 3符合5. 2.1. 2條件者，建立并檢驗(yàn)樣品稀釋濃度（C）與其相對(duì)發(fā)光度（T）%均值的相關(guān)方程，繪制 關(guān)系曲線。

按7. 2所述方法建立相關(guān)方程T=a+6C樣，并檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)r顯著水平（P值）。若P<0. 05,則所 求相關(guān)方程成立;反之，不能成立，須重測(cè)樣品稀釋系列濃度的發(fā)光量。

8根據(jù)測(cè)試結(jié)果表達(dá)樣品急性毒性

8.1用Y化汞濃度表達(dá)樣品毒性

8.1.1適用的條件

符合5.2.1. 3條件（樣品母液相對(duì)發(fā)光度大于1 %）并按7. 2建立了合格（PWO. Ol、EC5on化彖=0.10 士0. 02 mg/L）的Y化汞濃度與其相對(duì)發(fā)光度相關(guān)方程者。

8.1.2表達(dá)方法

GB/T 15441—1995

a.將測(cè)得的樣品相對(duì)發(fā)光度，代入7. 2的相關(guān)方程，求出與樣品急性毒性相當(dāng)?shù)牡瘽舛龋ㄒ?般用mg/L表示）；

b.測(cè)試結(jié)果報(bào)告同時(shí)列舉樣品相對(duì)發(fā)光度及其相當(dāng)?shù)?/span>綠化汞濃度值。 8.1.3適用性

適用于相對(duì)發(fā)光度在1%以上、特別是50%以上（即不可能出現(xiàn)EC、。值）但低于100%（即仍有中、 低水平毒性）的樣品毒性測(cè)定。

8.2用ECs。值表達(dá)樣品毒性

8.2.1適用的條件

符合5. 2.1. 2條件（樣品母液相對(duì)發(fā)光度低于50%乃至零）并按7.1建立了合格（P<0. 05）的樣品 稀釋液濃與其相對(duì)發(fā)光度相關(guān)方程者.

8.2.2表達(dá)方法

a.將T=50代入7. 3建立的相關(guān)方程，求出樣品的EG。值。這里的EC*值以樣品的稀釋濃度（一 般用百分濃度）表示；

b.測(cè)試結(jié)果報(bào)告列舉樣品的ECg值•

8.2.3適用性

適用于相對(duì)發(fā)光度在50%以下、特別是零（即毒性水平較高或很高）的樣品毒性測(cè)定，后者無法以 相當(dāng)?shù)?/span>Y化汞濃度表達(dá)毒性。

8.3測(cè)定記錄格式（見表3）

表3樣品急性毒性發(fā)光細(xì)菌測(cè)定法實(shí)驗(yàn)記錄

測(cè)定日期 測(cè)定人 提取方式

L=a+bC, a= 6=

回歸方程 P<

GB/T 15441-1995

8.4測(cè)定結(jié)果報(bào)告內(nèi)容

a.實(shí)驗(yàn)室室溫；

b.采樣地點(diǎn)、日期、時(shí)間；

c.Y化汞濃度或樣品稀釋百分濃度與相對(duì)發(fā)光度的相關(guān)方程：

T = a + bC

『= 尸< ECS0«<t«= mg/L

d.樣品EC5。值（稀釋百分濃度）或相對(duì)發(fā)光度（%）及其相當(dāng)?shù)?/span>綠化汞濃度（mg/L）；

e.測(cè)定人及所在單位。

9方法的精密度    

附加說明：

本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家*科技標(biāo)準(zhǔn)司提出，本標(biāo)準(zhǔn)由*南京土壤研究所負(fù)責(zé)起草。 本標(biāo)準(zhǔn)起草人顧宗濂、謝思琴、周德智、喬鴻澤。

本標(biāo)準(zhǔn)委托中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站負(fù)責(zé)解釋。