液滴微流控（六）：單細胞高通量液滴測序（Drop-seq）

細胞是生物結(jié)構與功能的基本單位，形態(tài)類型千差萬別。通過細胞基因組學，可以描述細胞特性及功能，本文所介紹的單細胞（single-cell）高通量液滴測序（Drop-seq）技術，是一種快速分析成千上萬個單細胞的方法，通過將每個細胞包裹在納升級微滴中，進行RNA雜交并生成mRNA轉(zhuǎn)錄物，制作細胞基因表達譜，進一步可分析mRNA轉(zhuǎn)錄物的起源細胞。

原理簡述

Drop-Seq基于液滴微流控技術，首先，將細胞懸浮液與帶有分子條形碼的微珠懸浮液泵至微流控芯片，匯聚并形成層流，之后再與油相匯聚，形成單分散的微滴，將每個細胞與一個微珠一同包裹于同一微滴中，隨后完成RNA雜交并裂解微滴，釋放mRNA雜交物，完成逆轉(zhuǎn)錄，后，以PCR方式完成核酸擴增，并進行測序分析。

測序過程

1.準備材料：從組織中分離細胞，制備細胞懸浮液；制備帶有分子條形碼的微珠懸浮液。

2.制備微滴：將細胞懸浮液與微珠懸浮液泵至芯片，再與油相匯聚形成單分散的微滴，將每個細胞與一個微珠一同包裹于同一微滴中。

3.RNA雜交：裂解微滴中的細胞，細胞釋放mRNA，與微珠上的分子條形碼雜交。

4.逆轉(zhuǎn)錄：裂解微滴，釋放mRNA雜交物，開始逆轉(zhuǎn)錄，以形成mRNA逆轉(zhuǎn)錄物（STAMPS）。

5. PCR擴增：在核酸外切酶的作用下，將每條mRNA逆轉(zhuǎn)錄物“切下”，并以PCR方式進行核酸擴增，以放大基因信息。

6.測序分析：使用各種生物信息學工具進行測序分析。

為什么用液滴微流控？

液滴微流控將微體積樣本快速分離，可實現(xiàn)成千上萬個細胞的平行高通量分析，通常情況下，每秒可產(chǎn)生1000個微滴，每個微滴的體積為1nL，因此在試劑量上來講，成本將成千倍的降低，此外，其實驗過程無需用到流式熒光細胞儀等儀器，操作簡單、快捷。

液滴測序芯片圖解

此微流控芯片是開源的

液滴測序系統(tǒng)配置

液滴測序系統(tǒng)主要組件：

1.三個Flow EZ壓力泵或一個MFCS EZ壓力泵（四通道）。

2.三個流量監(jiān)測傳感器。

3.一個數(shù)字高速顯微鏡。

4.液滴測序微流控芯片。

Drop-Seq，其應用遠不止對細胞形態(tài)類型的識別。目前，基因組遺傳學研究正在研究識別許多導致疾病風險的基因，但生物學缺乏類似液滴測序的高通量基因識別方法，此外，將液滴測序與突變、病原體刺激等微擾動相結(jié)合，可以對多種細胞進行一個信息豐富的、多維度的解讀，揭示微擾動對細胞的影響。

參考文獻：

[1]. Macosko E , Basu A , Satija R , et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets[J]. Cell, 2015, 161(5):1202-1214.