TUNEL法檢測細胞凋亡實驗原理和經(jīng)驗總結

 細胞凋亡內(nèi)容前面也介紹了幾篇內(nèi)容，相信大家對細胞凋亡的基本概念、細胞凋亡不同時期的主要特征及常用檢測方法都有了一定程度的了解。本期，將為大家講解TUNEL法檢測細胞凋亡實驗原理和經(jīng)驗總結 。

一、TUNEL法的實驗原理

細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。由此，TUNEL成為了檢測DN段化（細胞凋亡）的方法。（以下是TUNEL法細胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光））

 TUNEL檢測：使用10 U/ml Dnase處理Hela細胞10分鐘

二、TUNEL實驗中關鍵步驟

1.充分脫蠟和水化。脫蠟可以先 60ºC 20 min，再用使用二甲苯兩次 5-10 min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，這些以便后面的結合反應充分、均勻；

2.把握好細胞通透的時間。一般根據(jù)切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時間，常用 10-30 min，幾 μm 切片用短時間；幾十 μm 切片用長時間，通過摸索達到既不脫片，有能夠使后面的酶和抗體進入胞內(nèi)。

3.適當延長 TUNEL 反應液的時間。一般是37ºC 1 h，你也可以根據(jù)你的凋亡損傷程度，選擇更長的時間，可長至 2 h，但要結合你終的背景著色。

4.DAB 顯色條件的選擇。一般 DAB 反應10 min 左右，結合鏡下控制背景顏色，長不超過 30 min；promega 公司提供的 DAB 液（桃紅色），不利于辨認棕褐色，我不太喜歡。

5.PBS 的充分清洗。我個人認為，在 TUNEL 反應后和酶標反應后的清洗應十分嚴格，可增加次數(shù)達 5 次，因為這些清洗直接決定后切片的非特異性著色。

6. 此外，內(nèi)源性 POD 的封閉也十分關鍵。對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織，我的經(jīng)驗是適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度，可以達到很好的封閉效果，且不影響終的特異性染色。

三、細胞通透的時間選擇

1.蛋白酶 k 的目的是通透細胞膜和核膜，從而使反應試劑充分進入細胞核進行反應，提高陽性率。但濃度過高或孵育時間太長容易脫片，只要不脫片，好像影響不大，其作用類似與 TritonX100 等細胞通透劑。

2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,但濃縮液可配制1-10 mg/ml，可用 PBS 配制，也可用蛋白酶K緩沖液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；然后分裝成小份，用完一支再用下一支，-20ºC保存 1 個月應該沒問題的（重復拿的那支），而一直冷凍的至少可以用半年以上。

3. 蛋白酶K反應時間一般為10-30 min，具體時間長短與切片厚薄有關，4 μm左右的片子可以用 10 min，但30 μm左右的可用30 min，終通過摸索時間。過長易脫片、過短起不到通透效果。

關鍵試劑操作條件

DAB 顯色反應大約需要10 min，要控制好反應時間，勿使背景顏色過深。具體的可能還是得根據(jù)切片組織來源和切片厚度、試劑盒種類不同來摸索一下。

蛋白酶K工作液處理時間、溫度須在范圍內(nèi)摸索，溫度過高，時間過長，易破壞核酸結構，出現(xiàn)假陽性。

DNase 1 一般室溫，10 min 即可。

四、如何減弱非特異性染色

若是肝臟或腎臟，因富含內(nèi)源性過氧化物酶，需要增加過氧化氫濃度和延長孵育時間。其他還可以加強滅活、縮短 DAB 孵育時間、PBS 充分清洗，注意鏡下把握好著色。

Tips

1.濕盒用帶蓋方盤，里面固定幾根玻璃吸管用于放玻片，使用時稍加水即可。

2.英文說明書中對組織細胞通透這一步中，加了“對難處理的組織的處理”，意思是用常規(guī)方法處理（如蛋白酶 K)后，應該陽性而做不出陽性時，可用微波修復。

3.復染的目的是為了襯托組織形態(tài)結構，以利于結果分析，石蠟切片常用蘇木素，核染成蘭色，冷凍切片常用甲基綠，核染成綠色。

4.PBS 用蒸餾水、Na2HPO4、KH2PO4配制，現(xiàn)在有賣的，自己加蒸餾水稀釋后即可用，很方便，也不貴。

5.蛋白酶 K 消化蛋白后，需要用封閉液。

（本文轉自每日生物評論）