客戶案例｜輝瑞在多個實驗室同時部署MAM

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引言

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Multi-Attribute Method(MAM)這一概念于2015年首見于發(fā)表文獻中1，由Richard Rogers等人共同提出，引起了生物制藥界的廣泛關(guān)注，在范圍內(nèi)的學(xué)術(shù)會議/論壇中始終處于生物制藥策略相關(guān)對話的焦點位置。

作為一種基于肽圖分析的工作流程，得益于高效液相色譜-超高分辨質(zhì)譜聯(lián)用平臺，MAM能夠同時提供多個產(chǎn)品質(zhì)量屬性（product quality attributes, PQAs）的相對定量結(jié)果，兼具高分辨率、高質(zhì)量精度與高靈敏度，使得復(fù)雜基質(zhì)中的低含量修飾組分也可獲得高度可信的定量結(jié)果，從而幫助研究人員對PQAs更加深入的理解并優(yōu)化生產(chǎn)工藝流程2。與此同時，系統(tǒng)良好的穩(wěn)健性與重現(xiàn)性為跨實驗室部署MAM提供了可能。

客戶案例分享：

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建設(shè)面向未來的MAM實驗室

作為大的以研發(fā)為基礎(chǔ)的生物制藥公司，創(chuàng)新是改善健康狀況并保持輝瑞持續(xù)增長和收益的關(guān)鍵所在。輝瑞致力于為世界提供高品質(zhì)的健康產(chǎn)品，并產(chǎn)出*利益相關(guān)者所期待的高品質(zhì)結(jié)果。為支持公司的研究目標，質(zhì)譜與生物物理表征組（Mass Spectrometry and Biophysical Characterization, MSBC group）的任務(wù)之一就是以開放、協(xié)作和及時的方式使用的表征策略、的儀器和創(chuàng)新的分析方法，闡明生物治療藥物的分子結(jié)構(gòu)并終助力藥物的研發(fā)和商業(yè)化。因此，MAM工作流程進入了MSBC組的視野。

如前文所述，對于多個PQA，MAM工作流程能夠同時進行特定修飾位點的發(fā)現(xiàn)、鑒定、定量和監(jiān)控。 與可能無法提供特定修飾位點信息的傳統(tǒng)檢驗方法相比，MAM可以直接為PQA提供定量評估結(jié)果，從而增強了研究人員對于過程和產(chǎn)品的理解。 對于輝瑞而言，他們的目標是在新產(chǎn)品開發(fā)伊始初的表征階段之后便通過MAM對各種樣品進行PQA監(jiān)控、指導(dǎo)過程開發(fā)和結(jié)構(gòu)功能研究，并終控制策略和規(guī)范設(shè)置。

因此，輝瑞公司成立了專門的團隊并實施了一個多站點MAM“未來實驗室”簡化PQA分析。

輝瑞的MAM歷程

輝瑞的MAM團隊在抗體藥物臨床前早期研發(fā)階段就會引入MAM工作流程，對未施加壓力條件/加速壓力條件的原料藥進行深度表征，對比所有預(yù)期/非預(yù)期的翻譯后修飾和化學(xué)修飾的變化?；谫惸w所提供的儀器和軟件平臺，MSBC組可以為每個產(chǎn)品建立全面的關(guān)鍵PQA工作列表，并轉(zhuǎn)移至后續(xù)的PPL生化/分離組（Project Progression Lines（PPL）biochemistry/separation science groups）用于PQA監(jiān)控。因此，他們期望MAM能夠為PPL組提供額外的功能，以更廣泛的矩陣形式來監(jiān)控具有位點特異性的多種屬性，同時作為潛在的、可信的放行/穩(wěn)定性/鑒定和/或簡化工作流程以提高效率。

另外，輝瑞MAM團隊還將此工作流程用于與生產(chǎn)工藝改進和不同實驗室間變更相關(guān)的可比性研究實操。對于MSBC組和PPL生化/分離組而言，組內(nèi)MAM的培訓(xùn)和方法轉(zhuǎn)移是他們的短期目標。放眼長遠，儀器和軟件的日趨成熟與直觀性增強，對非質(zhì)譜背景的操作人員更加友好，使得將MAM*整合至質(zhì)量控制（quality control, QC）實驗室、制劑團隊和GMP 生產(chǎn)車間成為可能。

輝瑞將MAM引入分析過程中可以獲得的關(guān)鍵得益如下：

1、MAM是基于LC-MS平臺的一體化流程，可以同時對多個PQA進行分析，提供位點特異性的信息，可在日常分析中有效補充鑒定、放行和穩(wěn)定性相關(guān)信息（圖2）。

2、MAM允許對已知PQA自動監(jiān)控和定量，并且能夠?qū)^程和產(chǎn)品開發(fā)中出現(xiàn)的新峰進行檢測，有助于建立針對產(chǎn)品特異性的、規(guī)章制度化的和整體的科學(xué)知識。

輝瑞對MAM的發(fā)展

如圖3所示，MAM包括數(shù)個必須要素。工作流程以快速酶解開始（通常使用胰酶），能夠保持樣品的翻譯后修飾（如N/O-糖基化修飾，唾液酸等），并大程度上減少酶解過程所引入的修飾（例如溫度/pH所導(dǎo)致的脫酰胺和氧化等）。MSBC組對產(chǎn)品進行深度表征，獲得位點特異性的PQA列表后，將該列表轉(zhuǎn)移至PPL組，隨后PPL組將此列表導(dǎo)入變色龍中，并使用LC-MS only的策略對PQA進行日常監(jiān)控。色譜高度重現(xiàn)的保留時間、質(zhì)譜的高分辨率/高質(zhì)量精度以及同位素峰分布信息使得基于一級質(zhì)譜信息來自動對庫中的PQA鑒定并定量成為可能。

圖3 輝瑞的MAM工作流程示意圖。MSBC 組進行初始的LC-MS/MS表征并確定位點特異性的PQA列表。隨后PPL組使用該列表，通過LC-MS方法進行PQA的日常監(jiān)控。（點擊查看大圖）

在選擇PQA進行監(jiān)控和定量時，如何將PQA數(shù)目控制在合理范圍內(nèi)，以確保監(jiān)控過程的快速與可信顯得尤為重要。因此，在實驗的初篩階段建立PQA列表時，可以先選擇一些廣為人知的PQA，例如N-糖基化、N-/C-末端修飾和其他常見修飾，如天冬酰胺脫酰胺、天冬氨酸異構(gòu)化和甲硫氨酸/色氨酸氧化等，以監(jiān)控可能的降解。隨著研究過程的深入，由于對產(chǎn)品有了更加全面的了解，可以將更多PQA添加至初篩得到的PQA列表中，從而保證對產(chǎn)品一致性的全面監(jiān)控。得益于變色龍軟件的靈活性，PQA列表的實時更新非常容易實現(xiàn)。

系統(tǒng)的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性是保證MAM能夠獲得長期成功的關(guān)鍵要素之一。目前賽默飛*建議的系統(tǒng)穩(wěn)定性評估是使用商品化的BSA酶解肽段標準品進行系統(tǒng)穩(wěn)定性測試。與使用合成肽段標準品進行系統(tǒng)穩(wěn)定性評估相比，雖然合成肽段標準品能夠?qū)AM的幾個關(guān)鍵要素，例如色譜保留時間、色譜峰型/峰寬，質(zhì)譜質(zhì)量精確度進行評估，除此之外BSA酶解肽段標準品還能提供額外的屬性用于監(jiān)控，例如樣品前處理引入的化學(xué)修飾比例和源內(nèi)裂解等。將BSA酶解肽段標準品作為系統(tǒng)穩(wěn)定性測試的標準品，可以從儀器裝機開始便一直用同一套標準評判系統(tǒng)表現(xiàn)與穩(wěn)定性。

輝瑞同樣也選擇了一個內(nèi)部生產(chǎn)的單抗標準品用于MAM應(yīng)用的日間穩(wěn)定性監(jiān)控。選用此標準品的意義在于，可以在BSA酶解肽段標準品的基礎(chǔ)上對酶解的穩(wěn)健性進行評估。

來自于輝瑞的MAM實際應(yīng)用案例

在近的一次網(wǎng)絡(luò)講座(Understanding Biotherapeutic Product Quality Attributes through a Multi-Attribute Method (MAM) Lab-of-the-Future, available on-demand)中，輝瑞MAM團隊*科學(xué)家Andrew Dawdy介紹了MAM工作流程的部分實際應(yīng)用案例。

案例一

N-糖型定量：傳統(tǒng)2-AB標記法與MAM 的對比

在此案例中，研究團隊選擇了三批來自不同生物反應(yīng)器的樣品，分別采用糖苷酶切除糖鏈，隨后使用2-AB標記并檢測的傳統(tǒng)方法，和MAM對N-糖肽進行相對定量結(jié)果進行對比。如圖4所示，對于主要/次要/痕量級糖型，MAM（藍色柱狀圖）與傳統(tǒng)方法（黑/灰色柱狀圖）的定量結(jié)果高度吻合。

圖4 MAM與傳統(tǒng)2-AB標記-HILIC-FLR法對來源于三個不同生物反應(yīng)器樣品的N-糖型定量結(jié)果對比。兩種方法對主要/次要/痕量糖型的定量結(jié)果高度吻合。（點擊查看大圖）

案例二

通過MAM鑒定電荷變異體并精確定位至修飾位點

在強制降解研究中，將某單抗產(chǎn)品在40℃下孵育18周，隨后分別使用成像毛細管電泳（imaged capillary electrophoresis, iCE ）和MAM對其進行電荷變異體分析。兩種不同分析方法的結(jié)果高度相似。然而，iCE能夠提供的是全局層面的電荷變異體信息，意味著無法得到鑒定信息，或是將導(dǎo)致電荷異質(zhì)性的因素細化到某一特定位點上；與此相反，對于每個酸性變異體相關(guān)的PQA，MAM均能提供全面的鑒定和位點特異性信息，從而幫助研究人員更好的理解每個位點的變化對于電荷異質(zhì)性的貢獻（圖5）。除了能夠提供修飾位點的精確信息，MAM還能夠提供更加全面的信息。例如，傳統(tǒng)氧化分析方法只能提供Fc區(qū)一個目標位點的定量結(jié)果，而MAM可以同時提供多個位點/多種氧化修飾的定量結(jié)果。

圖5 使用MAM對電荷變異體進行精確到位點的鑒定與定量。（點擊查看大圖）

案例三

使用MAM研究制劑對于非酶解相關(guān)的賴氨酸糖化的影響

對于案例二中的強制加熱降解樣品，研究人員使用MAM評估了含蔗糖制劑和含海藻糖制劑對于賴氨酸糖化的影響。由圖6能夠看出，MAM可以提供精確至位點的賴氨酸糖化定量信息，可以明顯觀察到含蔗糖制劑的糖化比率遠遠高于含海藻糖制劑。與此同時，賴氨酸糖化的熱點也得到了鑒定。

圖6 使用MAM鑒定不同制劑中非酶解相關(guān)的賴氨酸糖化。由圖中可知，制劑一導(dǎo)致的賴氨酸糖化風(fēng)險更高。（點擊查看大圖）

小結(jié)

● 通過與賽默飛的合作，輝瑞成功地在多個實驗室部署了MAM，用于生物治療產(chǎn)品的發(fā)展；

● 使用MAM，可以實現(xiàn)用一種方法同時對多個PQA進行直接分析，在對產(chǎn)品獲得更深入理解的同時也大大提高了效率；

● 輝瑞目前正在積極實施MAM開發(fā)項目以支持非GMP下的PQA監(jiān)控，并對實際應(yīng)用角度的、為研發(fā)后期所開發(fā)的MAM工作流程進行評估；

● 到目前為止，MAM的數(shù)據(jù)與一些傳統(tǒng)分析手段可以很好地吻合，對于幾個發(fā)展中的項目，MAM已可以針對特定PQA，實時或通過追溯當前和以前的數(shù)據(jù)集對比來提供關(guān)鍵信息，以幫助解決與結(jié)構(gòu)/功能相關(guān)的關(guān)鍵問題；

● 輝瑞計劃在完成方法驗證以及必要的合規(guī)性和風(fēng)險評估后的3-5年內(nèi)，在QC實驗室實施MAM。

“One of the most important actions that have come from these meetings is Thermo Fisher Scientific’s readiness to incorporate changes in their software to make the method easier for the end user”

--Jason Rouse

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