GV3101 菌株使用操作說明

產(chǎn)品說明

GV3101 菌株為 C58 型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因 rif，為了便于轉化操作，此菌

株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型 Ti 質粒 pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此質粒含有 vir 基因 (vir 基因是

T-DNA 插入植物基因組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質粒自身的 T-DNA 轉移功能被破壞，但

可以幫助轉入的雙元載體 T-DNA 順利轉移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型 Ti 質粒含有篩選標簽：gent，

賦予 GV3101 菌株慶大霉素抗性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉基因操作。本公司生產(chǎn)

的 GV3101 化學轉化感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pCAMBIA2301 質粒檢測轉化效率>104 cfu/μg DNA。

常規(guī)操作方法

1. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中。

2. 每 100 μl 感受態(tài)加 1 μg（體積不大于 10 μl）質粒 DNA，用手管底混勻，依次于冰上靜置 5 分鐘、

液氮 5 分鐘、37℃水浴 5 分鐘、冰浴 5 分鐘。

3. 加入 700 μl 無抗生素的 LB 或 YEB 液體培養(yǎng)基，于 28℃振蕩培養(yǎng) 2~3 小時。

4. 6000 rpm 離心一分鐘收菌，留取 100 μl 左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的 LB 或 YEB

平板上，倒置放于 28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2-3 天

（當平板只含有 50 μg/ml kan 時，28℃培養(yǎng) 48 h 即可；平板中同時加入 50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時，

需 28℃培養(yǎng) 60 h；如果使用的平板含有 50 μg/ml rif 則需要 28℃培養(yǎng) 72-90 h）。

注意事項

1. 加入質粒時體積不應大于感受態(tài)體積的 1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，

轉化效率下降一個數(shù)量級。

2. 混入質粒時應輕柔操作。轉化高濃度的質?？上鄳獪p少終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量。

4. 利福平濃度不應高于 25 μg/ml，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。本公司 GV3101

感受態(tài)計算轉化效率時所用平板只含有 50 μg/ml kan，若所用平板含有 20 μg/ml rif 則轉化效率降低到 1/2。

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止 Ti 質粒丟

失，但鏈霉素不利于農(nóng)桿菌的轉基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti 質粒丟失的概率極低 (可

以忽略)。