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Sievers Eclipse*月食細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀的起效光密度值
目的
本應(yīng)用表明 Sievers*Eclipse 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀(BET，Bacterial Endotoxins Testing)所使用的起效光密度(OD，Optical Density)值與 96 孔微孔板測試所使用的起效光密度值是等效的。Sievers Eclipse 微孔板的孔的形狀和光路徑長度不同于 96 孔板的孔的形狀和光路徑長度，因此需要用比爾定律(Beer’s Law)和吸光度方程來重新計算 Sievers Eclipse 微孔板的光密度值。證明上述兩種平臺的光密度值的等效性非常重要，這是因為在動態(tài)顯色分析中，起效光密度值用于確定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的起效反應(yīng)時間。
概述
動態(tài)內(nèi)毒素測試依賴于光密度值和內(nèi)毒素濃度變化之間的反比關(guān)系。光密度是“用分光光度計測量的特定波長的有機分子懸浮液或溶液所吸收的光量。”1當(dāng)光通過含有標(biāo)準(zhǔn)品(或樣品)和鱟 試 劑 ( LAL ， LimulusAmoebocyte Lysate，鱟變形細(xì)胞溶解物)的混合液的光學(xué)孔時，軟件就會報告光密度值的變化。對于動態(tài)分析法來說，起效光密度值是用來確定起效反應(yīng)時間的恒定值。內(nèi)毒素濃度高的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)速度較快，溶液顏色會變黃，使到達(dá)光電二極管的光量較少，因而光密度值較高。起效反應(yīng)時間(即達(dá)到起效光密度所需的時間)越短，樣品中的內(nèi)毒素含量就越高。
每次測試完畢后，軟件都會生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示起效反應(yīng)時間(以對數(shù)形式)和標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)毒素濃度(以對數(shù)形式)之間的線性關(guān)系。然后將反應(yīng)性樣品和陽性產(chǎn)品對照液(PPC，Positive Product Controls)的起效反應(yīng)時間同標(biāo)準(zhǔn)曲線進行對比，得出內(nèi)毒素的量化結(jié)果。測得的起效光密度值經(jīng)過優(yōu)化，都被概括在使用說明(IFU，Instructions For Use)中。起效光密度值可以是一個定值，也可以是一系列值。起效光密度也被稱為“閾值光密度” 或 “反應(yīng)光密度”。
比爾定律
鱟試劑生產(chǎn)商記錄的光密度值是根據(jù)比爾定律和含有混合液的微孔板的測量厚度(即光路徑長度)計算出來的。比爾定律又 被 稱 “ 朗伯比爾定律( BeerLambert’s Law)”，規(guī)定：“溶液的化合物濃度與溶液的吸光量成正比。”2
朗伯比爾定律
?? = ?????
其中：
A = 吸光度(無單位)
? = 摩爾吸光系數(shù)(L mol-1cm-1)
b = 光通過溶液的路徑長度(cm)
c = 樣品中化合物的濃度(mol L-1)
為了充分理解上面的方程式，請看下面的吸光度方程式。吸光度取決于光強度。測量參照池或無溶液的池，得出光強度 Io。然后測量樣品池或有溶液的池，得出光強度 I。 將這兩個值代入以下公式，得出吸光度。
吸光度
在考慮吸光度時，光學(xué)孔的形狀和大小也很重要。光路徑為 1 cm 的立方體形孔中的溶液就比光路徑為100 cm 的管狀孔中的溶液的吸光度低，這是因為前者有較少分子與光相互作用。 Sievers Eclipse 微孔板的孔的形狀和路徑長度不同于 96 孔板的孔的形狀和路徑長度，因此需要用上述兩個方程式來重新計算起效光密度值。
Sievers Eclipse 的等效光密度不同的生產(chǎn)商或供應(yīng)商所提供的 96 孔板的光路徑長度略有不同。平底 96 孔板的孔通常是截錐形，使微孔板容易從模具上脫模。我們用幾家主要的微孔板生產(chǎn)商、儀器生產(chǎn)商、LAL 供應(yīng)商所提供的數(shù)據(jù)，根據(jù) 96 個孔中共有 200 µL 溶液來確定光路徑長度，得出的數(shù)值范圍是 5.707 mm - 6.306 mm。
為了將上述范圍縮小到一個定值，位于美國科羅拉多州博爾德市的蘇伊士水務(wù)技術(shù)與方案分析儀器公司(SUEZ WTS Analytical Instruments)的應(yīng)用實驗室重新測量了各種 96 孔板，得出了光路徑長度范圍的中間值。然后將該值代入以下方程式，就可以將 96 孔板測試中使用的起效光密度值轉(zhuǎn)換為適用于 Eclipse 平臺的等效起效光密度值。
用上面的計算公式以及 96 孔板和 Eclipse 微孔板的實測路徑長度，算出表 1 中的光密度值，用于 Eclipse 軟件。
我們并排測試了 96 孔板和 Eclipse 微孔板的光密度值，確認(rèn)這兩種平臺的所有的內(nèi)毒素、PPC、%CV(變異系數(shù))值都是等效的。如果鱟試劑生產(chǎn)商提供了光密度值范圍，則重新計算整個范圍，然后在 SieversEclipse 平臺上進行測試。兩種平臺的所有范圍之間的等效性都得到確認(rèn)，從而證明數(shù)值轉(zhuǎn)換是正確的，生成的數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確的。
如果您的實驗室使用各種起效光密度值，建議您進行測試，確定哪個值適用于各個樣品，因為當(dāng)測試完畢后，就無法在 Sievers Eclipse 軟件中更改起效光密度值。表 1 可以幫助您確定適用于您的樣品的等效光密度值。
結(jié)論
雖然 Eclipse BET 平臺和 96 孔微孔板的起效光密度值不同，但我們可以用現(xiàn)成的物理方程式來精確計算出它們的等效值，因此用戶可以放心使用 Eclipse 平臺測量出來的內(nèi)毒素結(jié)果。如需詳細(xì)的指導(dǎo)，請向您所在地的 Sievers 業(yè)務(wù)代表或應(yīng)用專家查詢。
參考文獻
1.McCullough, Karen Zink. The Bacterial Endotoxins Test: A PracticalApproach. DHI Publishing, LLC, 2011.
2.Helmenstine, Anne Marie. Beer’s Law Definition and Equation.ThoughtCo, 2019.
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