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樣品與鱟試劑的1:1比例：其重要性以及在Sievers Eclipse* 月食細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀上的確認(rèn)過程
目的
細(xì)菌內(nèi)毒素測試( BET ， Bacterial EndotoxinsTesting)的創(chuàng)新技術(shù)問世后，證明平臺(tái)間測試的等效性就變得至關(guān)重要。“Sievers*Eclipse 比例確認(rèn)測試” 旨在確認(rèn)使用 96 孔微孔板時(shí)的樣品與鱟試劑的 1:1 比例始終對(duì)使用 Eclipse 微孔板也同樣有效。只要保持 1:1比例，就能使樣品和鱟 試 劑 ( LAL ， LimulusAmoebocyte Lysate，鱟變形細(xì)胞溶解物)之間的生物化學(xué)反應(yīng)保持不變。 即使在使用 Sievers Eclipse 平臺(tái)時(shí)減少光學(xué)孔的總?cè)莘e，每個(gè)孔中的 1:1 比例也能保持不變，用戶可以確信樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)毒素測量值是準(zhǔn)確有效的。
背景和重要性
使用 96 孔微孔板的動(dòng)態(tài)顯色法細(xì)菌內(nèi)毒素檢測技術(shù)，要求在每個(gè)孔中加注標(biāo)準(zhǔn)品或樣品與鱟試劑的混合液，然后觀察液體的顏色變化。測試成功的關(guān)鍵在于精確控制樣品和鱟試劑的用量。USP <85> 規(guī)定，對(duì)于某些測試參數(shù)(例如體積比、反應(yīng)起效時(shí)間、pH 值等)，應(yīng)遵循鱟試劑生產(chǎn)商提供的使用說明(IFU，Instructionsfor Use)。
使用說明通常以下兩種方式之一來表明如何達(dá)到正確的樣品和鱟試劑的體積比：
(1)直接表明樣品和鱟試劑的比例應(yīng)為 1:1；
(2)指示用戶加入 100 µL 的空白鱟試劑水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、產(chǎn)品樣品、陽性產(chǎn)品對(duì)照，然后向所有使用的孔中加入 100 µL 的鱟試劑。
有的使用說明指示用戶準(zhǔn)備 1:1 樣品與鱟試劑混合液時(shí)，建議使用 100 µL(而非典型的 200 µL)作為孔的總?cè)莘e，并指出 100 µL 有助于達(dá)到的測試靈敏度。該使用說明表明，1:1 的比例關(guān)系(而非孔的總?cè)莘e)才是測試成功的關(guān)鍵。只要每個(gè)孔中的樣品和鱟試劑的比例是 1:1，反應(yīng)就能準(zhǔn)確進(jìn)行，產(chǎn)生的結(jié)果就是等效的。
如果比例不是 1:1，那么樣品與鱟試劑的用量就不對(duì)，就會(huì)對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過程和整體測試結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。除了孔的總?cè)莘e之外，還需考慮反應(yīng)速度。如果反應(yīng)較快，那么起始反應(yīng)時(shí)間就較短，內(nèi)毒素濃度就較高。如果反應(yīng)較慢，則情況相反——起始反應(yīng)時(shí)間較長，內(nèi)毒素濃度較低。
錯(cuò)誤的比例還會(huì)影響鱟試劑在與樣品混合時(shí)的自然緩沖能力。如果達(dá)不到 1:1 的精確比例，則反應(yīng)混合液的 pH 值就不在建議的 6 - 8 范圍之內(nèi)，就會(huì)影響測試的整體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過程。
1:1 比例確認(rèn)測試
1:1 比例確認(rèn)測試旨在證明在 Sievers Eclipse 微孔板的 104 個(gè)孔中都達(dá)到了鱟試劑和樣品的 1:1 精確比例。進(jìn)行測試時(shí)，用戶需要一個(gè)新的 Sievers Eclipse 微孔板和 Sievers Eclipse 1:1 比例確認(rèn)套件(部件號(hào)是STD 85000-01)，該套件包括一個(gè)水瓶和一個(gè)染色劑瓶。開始分析之前，Eclipse 軟件會(huì)指導(dǎo)用戶在對(duì)應(yīng)的位置和鱟試劑 LAL 端口，完成水和染色劑的準(zhǔn)備和注射。然后，Eclipse 微孔板按照正常分析時(shí)的步驟運(yùn)行。1:1 比例確認(rèn)測試不依賴于動(dòng)力學(xué)酶促反應(yīng)，因此測試所需的總時(shí)間較短。
1:1 比例確認(rèn)測試的報(bào)告內(nèi)容
分析完畢后，Eclipse 軟件的 “1:1 比例結(jié)果(1:1 RatioResults)” 選項(xiàng)卡中會(huì)顯示報(bào)告。報(bào)告內(nèi)容除了包括在運(yùn)行測試之前輸入的常規(guī)信息(例如分析儀序列號(hào)、Eclipse 微孔板信息、1:1 比例確認(rèn)樣品信息)，還包括104 個(gè)光學(xué)孔的各自的平均光密度。
在報(bào)告的 “結(jié)果” 部分下面，分別顯示微孔板的 “染色劑”部分和 “水” 部分的總體平均光密度。染色劑分別同微孔板另一半上的染色劑和水混合，產(chǎn)生上述兩個(gè)平均值。下面的方程 1 用于計(jì)算總體平均光密度值，該值顯示溶液的混合是否成功。這可以用來表示在正常分析時(shí)樣品和 LAL 是如何混合的。
方程式 1：
在染色劑與染色劑混合的孔中，理想的比例為 1(即染色劑平均值)。在染色劑與水混合的孔中，染色劑被稀釋到原來濃度的一半，理想的比例為 0.5(即水平均值)。將這兩個(gè)平均值相除，得出的理想比例為 2，表示到達(dá)光學(xué)孔的染色劑和水的量*相同。對(duì)于本次測試來說，1.90 至 2.10 之間的比例都是有效的，不影響整體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線和內(nèi)毒回收率。
結(jié)論
Sievers Eclipse 微孔板是精密設(shè)計(jì)的微流控液體處理設(shè)備。此款微孔板利用計(jì)量分配腔，以恒定的通道幾何形狀和運(yùn)動(dòng)方式，將精確等量的樣品和鱟試劑同時(shí)送到光學(xué)孔中。正是 Eclipse 微孔板的精密的液體控制能力，確保了每次測試的所有 104 個(gè)光學(xué)孔中都達(dá)到樣品與鱟試劑的 1:1 關(guān)鍵性比例。
鱟試劑生產(chǎn)商提供的使用說明可能會(huì)直接表明 1:1 比例，也可能會(huì)指導(dǎo)用戶混合一定量的樣品和鱟試劑，但液體總體積未必一定是 200 µL。如果光路徑較長，或者為了進(jìn)行精確移液，生產(chǎn)商會(huì)建議設(shè)置較大容積，以提高測試精度。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的 96 孔微孔板來說，建議設(shè)置的孔的總?cè)莘e在 75 - 200 µL 范圍內(nèi)。“為了進(jìn)行有效測量，建議設(shè)置的微孔板的小孔容積通常大于大孔容積的 1/3。”1所以，每次測試的每個(gè)孔中的樣品與鱟試劑的比例達(dá)到 1:1，非常重要，而沒有必要使用整個(gè)孔的容積。
在 Sievers Eclipse 平臺(tái)上進(jìn)行 1:1 比例確認(rèn)測試的結(jié)果證明，即使孔的總?cè)莘e顯著減小，每次測試的每個(gè)光學(xué)孔中都能達(dá)到至關(guān)重要的 1:1 比例。始終保持 1:1的精確比例，用戶就能確認(rèn)在轉(zhuǎn)換平臺(tái)時(shí)，生物化學(xué)過程是等效的。建議每年由 SUEZ 公司認(rèn)證的現(xiàn)場服務(wù)工程師或代表來完成此項(xiàng)確認(rèn)測試任務(wù)。
參考文獻(xiàn)
1.Pusterla, Tobias, PhD. “Which is the best microplate for my assay?”BMG Labtech, 2018 May 30.
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