體外哺乳類細胞基因突變（HGPRT）試驗原理及注意事項

體外哺乳類細胞基因突變（HGPRT）試驗原理及注意事項
 In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test

【試驗原理】
體外哺乳動物細胞基因突變試驗是利用培養(yǎng)的哺乳動物細胞作指示生物的體外遺傳毒理學(xué)試驗，可用于檢測有化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的基因突變，適用的細胞系包括小鼠淋巴瘤細胞（L5178Y），中國倉鼠肺細胞（V79），中國倉鼠卵巢細胞（CHO），人類淋巴母細胞（TK6）等。這些細胞系，常用的遺傳學(xué)終點是檢測胸苷激酶（TK）圖標，次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶（HPRT/HGPRT）圖標，黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶（XPRT）基因突變。TK、HPRT/HGPRT、XPRT突變試驗可以檢測不同的遺傳事件譜。
細胞在正常情況下，能產(chǎn)生HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶），在含有6-硫代鳥嘌呤（6-thioguanine,6-TG）的選擇性培養(yǎng)液中，HGPRT催化產(chǎn)生核苷-5^，-單磷酸（NMP），NMP摻入DNA中致細胞死亡。在致癌和（或）致突變物作用下，某些細胞X染色體上控制HGPRT的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，不能再產(chǎn)生HGPRT， 從而使突變細胞對6-TG具有抗性作用，能夠在含有6-TG的選擇性培養(yǎng)液中存活生長。在有或無代謝活化系統(tǒng)的條件下，將細胞培養(yǎng)物暴露于受試物中適當(dāng)時間，然后將細胞再傳代培養(yǎng)，在含有6-TG的選擇性培養(yǎng)液中，突變細胞會繼續(xù)分裂并形成集落，計數(shù)突變集落形成數(shù)，計算突變頻率，從而推斷受試物的致突變性。

【參考標準】
GB 15193.12-2014 體外哺乳類細胞HGPRT基因突變試驗

【材料和試劑】
細胞：常用中國倉鼠肺細胞株（V79）和中國倉鼠卵巢細胞株（CHO），其他如小鼠淋巴瘤細胞株（L5178Y）和人類淋巴母細胞株（TK6）亦可。細胞在使用前應(yīng)進行有無支原體污染的檢查。
培養(yǎng)液：應(yīng)根據(jù)試驗所用系統(tǒng)和細胞類型來選擇適宜的培養(yǎng)基。對于 V79和 CHO 細胞，常用-低必需培養(yǎng)基（MEM，Eagle）、改良 Eagle培養(yǎng)基（DMEM）加人10%胎牛血清和適量抗菌素。對于 TK6 和 L5178Y細胞，常用 RPMI 1640培養(yǎng)液，加人10%馬血清（培養(yǎng)瓶培養(yǎng)）或20%馬血清（96孔板培養(yǎng)）和適量抗菌素（青霉素、鏈霉素）。
胰蛋白酶/EDTA溶液：用無鈣、鎂 PBS配制，胰酶的濃度為0.05 %，EDTA 的濃度為0.02% ,胰蛋白酶與EDTA溶液按1:1混合。-20℃儲存。
活化系統(tǒng)：通常使用的是S9混合物。
選擇劑：6-硫代鳥嘌呤(6-TG)，建議使用終濃度為5μg/mL～15μg/mL,用碳酸氫鈉溶液(0.5 %)配制。
預(yù)處理培養(yǎng)液(THMG/THG)：為減少細胞的自發(fā)突變頻率，在試驗前，先將細胞加在含 THMG的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，清除自發(fā)的突變細胞，然后再將細胞接種于THG(不含氨甲喋呤的THMG培養(yǎng)液)中培養(yǎng)1d～3d至細胞恢復(fù)正常生長周期和形態(tài)。
THMG 所含各物質(zhì)終濃度如下(除培養(yǎng)液成分外):
————胸苷，5×10^-6 mol/L；
————次黃嘌呤，5×10^-5 mol/L；
————氨甲喋呤，4×10^-7 mol/L；
————甘氨酸，1×10^-4 mol/L；

【試驗方法】
一、受試物
受試物配制：固體受試物應(yīng)溶解或懸浮于適合的溶媒中，并稀釋至適當(dāng)濃度。液體受試物可直接使用或稀釋至適當(dāng)濃度。受試物應(yīng)在使用前現(xiàn)用現(xiàn)配，否則就必須證實貯存不影響其穩(wěn)定性。
溶媒的選擇：溶媒必須是非致突變物，不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不影響細胞存活和S9活性。首-選溶媒是蒸餾水；對于不溶于水的受試物可選擇其他溶媒，首-選二甲基亞礬(DMSO)，但使用時濃度不應(yīng)大于0.5%。
對照：
每一項試驗中，在有無代謝活化系統(tǒng)條件下均應(yīng)設(shè)陽性和陰性(溶媒)對照組。
 

• 陽性對照：當(dāng)使用代謝活化系統(tǒng)時,陽性對照物必須是要求代謝活化、并能引起突變的物質(zhì)，可以使用3-甲基膽蒽(3-methylcholanthrene)、N-亞硝基二甲-胺(N-nitroso-dimethylamine)、7,12-二甲基苯并[a]蒽(7, 12-dimethylbenz[a]anthracene)等。在沒有代謝活化系統(tǒng)時,陽性對照物可使用甲磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate)、乙基亞-硝基-脲(ethylnitrosourea)等。也可使用其他適宜的陽性對照物。
• 陰性對照：陰性對照(包括溶媒對照)除不含受試物外，其他處理應(yīng)與受試物相同。此外，當(dāng)不具有實驗室歷史資料證實所用溶媒無致突變作用和無其他有害作用時，還應(yīng)設(shè)空白對照。

二、劑量
-高濃度選擇：決定-高濃度的因素是細胞毒性、受試物在試驗系統(tǒng)中的溶解度以及pH 或滲透壓的改變。
細胞毒性確定：應(yīng)使用指示細胞完整性和生長情況的指標，在代謝活化系統(tǒng)存在和不存在兩種條件下確定細胞毒性，例如相對集落形成率或相對存活率。應(yīng)在預(yù)試驗中確定細胞毒性和溶解度。
濃度設(shè)置和-高濃度選擇：至少應(yīng)設(shè)置4個可供分析的濃度。當(dāng)有細胞毒性時，其濃度范圍應(yīng)包括從大毒性至幾乎無毒性，通常濃度間隔系數(shù)在2～√10之間；如-高濃度是基于細胞毒性，那么該濃度組的細胞相對集落形成率或相對存活率應(yīng)為 10%～20 %(不低于10% )。對于那些細胞毒性很低的化合物，-高濃度應(yīng)是5μL/mL、5mg/mL或0.01mol/L。對于相對不溶解的物質(zhì)，其-高濃度應(yīng)達到或超過在細胞培養(yǎng)狀態(tài)下的溶解度限值；-好在試驗處理開始和結(jié)束時均評價溶解度，因為由于S9等的存在，試驗系統(tǒng)內(nèi)在暴露過程中溶解度可能發(fā)生變化，不溶解性可用肉眼鑒別，但沉淀不應(yīng)影響觀察。
三、試驗步驟和觀察指標
貼壁生長細胞的試驗步驟和觀察指標：

• 細胞準備：將5×10⁵ 個細胞接種于直徑為10 mm平皿中，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
• 接觸受試物：吸去培養(yǎng)液，PBS洗兩次，加人一定量的無血清培養(yǎng)液、一定濃度的受試物及S9混合物(無需代謝活化者用無血清培養(yǎng)液補足），置于培養(yǎng)箱中3h～6h，結(jié)束后吸去含受試物的培養(yǎng)液，用 PBS洗細胞兩次，換入含10%血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)19h～22 h。
• 表達：接觸受試物的細胞繼續(xù)培養(yǎng)19h～22 h后用胰酶-EDTA 消化，待細胞脫落后，加入含10%血清的培養(yǎng)液終止消化，混勻，放入離心管以800r/min～1000r/min的速度離心5min～7min，棄上清液，制成細胞懸液，計數(shù)，以5×10⁵ 個細胞接種于直徑為10 mm 的平皿，3d后傳代，仍接種5×10⁵個細胞培養(yǎng)3d（-佳表達時間為6d～8d）。
• 細胞毒性測定：將上述*消化計數(shù)后的細胞每皿接種200個，每組5個皿，37℃、5二氧化碳條件下培養(yǎng)7d，固定，Giemsa染色，計數(shù)每皿集落數(shù)。
• 突變體的選擇及集落形成率的測定：表達結(jié)束后，消化細胞，分種，每組5個皿，每皿接種200個細胞，不加6-TG，7d后固定，Giemsa染色，統(tǒng)計每皿集落數(shù)，計算集落形成率。同時另做突變頻率測定，每組5個皿，每皿接種2×10⁵個細胞，待細胞貼壁后加人6-TG（建議使用終濃度為5μg/mL～10μg/mL），放人培養(yǎng)箱培養(yǎng)8d～10d后固定，Giemsa染色，統(tǒng)計每皿集落數(shù)，并計算突變頻率。

懸浮生長細胞的試驗步驟和觀察指標：

• 細胞準備及接觸受試物：取生長良好的細胞，調(diào)整密度為5×10⁵/mL，按1%體積加入一定濃度的受試物及S9混合物（無需代謝活化者用無血清培養(yǎng)液補足），37 ℃振搖處理3h～6h，以800r/min～1000r/min的速度離心4min～6min，棄上清液，用PBS或無血清培養(yǎng)液洗細胞2次，重新懸浮細胞于含10%馬血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，并調(diào)整細胞密度為2×10⁵/mL。
• PE₀（0天的平板接種效率）測定：取適量細胞懸液，作梯度稀釋至8個細胞/mL，接種96孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6個細胞/孔），每個劑量接種1～2塊平板，37℃，5 二氧化碳，飽和濕度條件下培養(yǎng)9d～11d，計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)。
• 表達：取上一步所得細胞懸液，作6d表達培養(yǎng)，每天計數(shù)細胞密度并保持密度在1×10⁶/mL以下。
• PE₆（第六天的平板接種效率）測定：表達培養(yǎng)結(jié)束后，取適量細胞懸液，按PE₀（0天的平板接種效率）測定方法測定PE₆。
• 突變頻率（MF）測定：表達培養(yǎng)結(jié)束后，取適量細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×10⁵/mL，加人6-TG（建議使用終濃度為5μg/mL～15μg/mL），混勻，接種96孔板（每孔加0.2mL，即2×10⁴ 個細胞/孔），每個劑量接種2～4塊平板，37℃，5%二氧化碳，飽和濕度條件下培養(yǎng)11d～14d，計數(shù)有突變集落生長的孔數(shù)。

【數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評價】

• 數(shù)據(jù)處理

貼壁生長細胞 HGPRT試驗數(shù)據(jù)處理：
細胞毒性：以相對于溶媒對照組的集落形成率表示細胞毒性。即以溶媒對照的集落形成率為100%(1.00),求出各受試物組的相對值。
 

• 集落形成率和突變頻率：

 
懸浮生長細胞 HGPRT試驗數(shù)據(jù)處理：

• 平板接種效率(PE₀、PE₆)：

• 相對存活率（RS）：

• 突變頻率（MF）：

• 結(jié)果評價：
• 陽性結(jié)果的判定：

受試物組在任何一個劑量條件下的突變頻率為陰性（溶媒）對照組的3倍或3倍以上，可判定為陽性。
受試物組的突變頻率增加，與陰性（溶媒）對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義，并有劑量-反應(yīng)趨勢，則可判定為陽性。
受試物組在任何一個劑量條件下引起具有統(tǒng)計學(xué)意義的增加并有可重復(fù)性，則可判定為陽性。

• 陰性結(jié)果的判定：

不符合上述陽性結(jié)果判定標準，則可判定為陰性。

【試驗報告】

• 試驗名稱、試驗單位名稱和聯(lián)系-方式、報告編號。
• 試驗委托單位名稱和聯(lián)系-方式、樣品受理日期。
• 試驗開始和結(jié)束日期、試驗項目負責(zé)人、試驗單位技術(shù)負責(zé)人、簽發(fā)日期。
• 試驗摘要。
• 受試物：名稱、鑒定資料、CAS編號（如已知）、純度、與本試驗有關(guān)的受試物的物理和化學(xué)性質(zhì)及 穩(wěn)定性等。
• 溶媒和載體：溶媒和載體的選擇依據(jù)，受試物在溶媒和載體中的溶解性和穩(wěn)定性。
• 細胞株：名稱、來源、濃度及培養(yǎng)條件（包括培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)溫度、CO₂濃度和培養(yǎng)時間）。
• 試驗條件：劑量、代謝活化系統(tǒng)、標準誘變劑、操作步驟等。
• 試驗結(jié)果：各劑量組受試物（加和不加S9）對細胞的毒性和突變頻率的均數(shù)和標準差、是否具有劑量-反應(yīng)關(guān)系、統(tǒng)計結(jié)果，同時進行的陰性（溶媒）對照和陽性對照的均數(shù)和標準差、以及陰性（溶媒）對照和陽性對照的歷史范圍。

結(jié)論：本試驗條件下受試物是否具有致突變作用。

【試驗解釋】
若陰性對照中，集落形成率或存活率低于50%，結(jié)果應(yīng)不采用。各實驗室選用的陽性對照突變頻率有一定范圍，若受試物的結(jié)果為陰性或弱陽性時，陽性對照的誘變率應(yīng)達正常值的下限以上，否則結(jié)果不能成立。

HGPRT基因突變試劑盒
北京匯智泰康針對體外哺乳類細胞HGPRT基因突變試驗開發(fā)HGPRT基因突變試劑盒，試劑盒提供了進行體外哺乳類細胞HGPRT基因突變試驗所需的主要試劑和細胞(V79)，可用于評價受試物的致突變作用。所用細胞和試劑均符合國標GB 15193.12-2014 《食品安全-國家標準 體外哺乳類細胞HGPRT基因突變試驗》的要求。
20mL×24體系/盒，4個劑量組。

【產(chǎn)品使用說明】
1、細胞復(fù)蘇
收到試劑盒后，請盡快復(fù)蘇細胞。
從-70℃冰箱中取出細胞，于37℃水浴融化，離心，棄上清，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸；再次離心，棄上清，用10% FBS培養(yǎng)基，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，放置于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后期細胞傳代比例為1:3。
2、自發(fā)突變細胞清除
取對數(shù)生長期細胞懸液，于含1% （V/V）的THMG的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，離心，洗滌后將細胞接種于含1% （V/V）的THG（不含氨甲喋呤）培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)1d~3d，至細胞恢復(fù)正常生長周期和形態(tài)。
注：為確保試驗的可行性，試驗中所用細胞的自發(fā)突變率應(yīng)在5×10^-6~20×10^-6之間，清除自發(fā)突變的細胞傳代使用不得超過1個月，且每次試驗前需將細胞清除自發(fā)突變。
3、染毒處理
將5×10⁵個細胞接種于直徑為100mm的平皿中，于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中放置培養(yǎng)24h。吸去培養(yǎng)液，PBS洗兩次，加入一定量的無血清培養(yǎng)液、一定濃度的受試物及10%S9混合液（無需代謝活化者用無血清培養(yǎng)液或S9反應(yīng)液PS補足），置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~6h，結(jié)束后吸去含受試物的培養(yǎng)液，用PBS洗細胞兩次，換入含10%血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)19~22h，每個試驗組平行處理兩份培養(yǎng)物。
（1）S9混合液及染毒用細胞液配制

注：在試驗過程中，需根據(jù)實際需求，調(diào)整配制量。
（2）推薦染毒培養(yǎng)體系配制方案（試劑盒僅提供1次完整實驗的4個劑量組所需）

注：1.染毒時間可根據(jù)實際情況進行調(diào)整，一般為3h~6h，必要時可延長到1個或多個細胞周期。
2.如進行短時間染毒，可直接加入稀釋并混合均勻的絲裂-霉素C；若進行24h染毒，則需將絲裂-霉素C再稀釋2.5倍后再加入。
4、表達培養(yǎng)
接觸受試物的細胞繼續(xù)培養(yǎng)19~22h后，用胰酶-EDTA消化，待細胞脫落后，加入含10%血清的培養(yǎng)液終止消化，混勻，放入離心管中800r/min~1000r/min的速度離心5~7min，棄上清液，制成細胞懸液，計數(shù)，以5×10⁵個接種于直徑為100mm的平皿，3d后傳代，仍接種5×10⁵個細胞培養(yǎng)3d（-佳表達時間為6d~8d）。
5、細胞毒性測定
將上述*消化計數(shù)后的細胞每皿接種200個，每組5個皿，37℃、5%的二氧化碳條件下培養(yǎng)7d，固定，Giemsa染色，計數(shù)每皿集落數(shù)。
以相對于溶媒對照組的集落形成率表示細胞毒性，即以溶媒對照的集落形成率為100%，求出各受試物組的相對值。計算公式見（1）：
A=B/C×100%------------------------------------------（1）
式中：A—相對集落形成率，%；B—受試物組集落形成率，%；C—溶媒對照組集落形成率，%。
6、突變體的選擇和集落形成率的測定
表達培養(yǎng)結(jié)束后，消化細胞，分種，每組5個皿，每皿接種200個細胞，不加6-TG，7d后固定，Giemsa染色，統(tǒng)計每皿集落數(shù)，計算集落形成率。同時另做突變頻率測定，每組5個皿，每皿接種2×10⁵個細胞，待細胞貼壁后，按照千分之一的比例加入6-TG，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8~10d后固定，Giemsa染色，統(tǒng)計每皿集落數(shù)，計算突變頻率。
集落形成率計算見式（2）：
D=E/F×100%-------------------------------------------（2）
式中：D—集落形成率，%；E—實際存活的細胞集落數(shù)；F—接種細胞數(shù)。
突變頻率計算見式（3）：

式中：G—突變頻率；H—突變集落數(shù)；I—接種細胞數(shù)；D—集落形成率。
7、結(jié)果評價
7.1 實驗成立條件
若陰性對照中，集落形成率低于50%，結(jié)果應(yīng)不予采用。
若受試物的結(jié)果為陰性或弱陽性時，陽性對照的誘變率應(yīng)達正常值的下線以上，否則結(jié)果不成立。
7.2 結(jié)果判定
受試物組在任何一個劑量下的突變頻率為陰性（溶媒）對照組的3倍或3倍以上，可判定為陽性。
受試物組的突變頻率增加，與陰性（溶媒）對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義，并有劑量-反應(yīng)趨勢，則可判定為陽性。
受試物組在任何一個劑量條件下引起具有統(tǒng)計學(xué)意義的增加并有可重復(fù)性，則可判定為陽性。
不符合上述陽性結(jié)果判定標準，則可判定為陰性。
【注意事項】
實驗前請自行準備胎牛血清、RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胰酶-EDTA、Giemsa染色液、100mm平皿、滅菌槍頭、無菌移液管、二氧化碳培養(yǎng)箱、振蕩器、50mL離心管等，所有耗材需做無菌處理。