活細胞成像中環(huán)境的控制

pH值是細胞系高效生長的關(guān)鍵。

例如，大多數(shù)細胞系在pH 7.2-7.4時繁殖最好，成纖維細胞在pH 7.7時繁殖旺盛，轉(zhuǎn)化細胞系在pH 7左右時表現(xiàn)優(yōu)異。為了跟蹤細胞生長過程中培養(yǎng)基pH值的變化，在某些情況下使用苯酚紅作為pH值的指示劑，pH值為7.4時為紅色。苯酚紅在酸性溶液中變?yōu)槌壬?pH 7)和黃色(pH 6.5)，在堿性溶液中變?yōu)榉凵?pH 7.6)和紫色(pH 7.8)。然而，在活細胞成像中常用的培養(yǎng)基配方避免使用酚紅，因為其光吸收消光系數(shù)高，可能造成背景噪音。

pH緩沖系統(tǒng)通常包含碳酸氫鈉和外部供應CO2。此外，合成的生物緩沖液，如HEPES，可用于短期研究時緩沖培養(yǎng)基。當細胞外溶液不能用HEPES緩沖時，CO2被輸送到系統(tǒng)，當與細胞外溶液接觸時分解為碳酸氫鹽。這就是為什么顯微鏡下的活細胞成像通常需要專門可調(diào)節(jié)大氣而設計的培養(yǎng)室。一般情況下，10-20mM HEPES緩沖液的濃度可以在無CO2存在時控制pH值，為碳酸氫鈉提供最佳的生長條件。

細胞系對氧氣的需求量變化很大。

哺乳動物細胞在體內(nèi)呼吸通常需要氧氣，但在體外培養(yǎng)成種子細胞系或永生化后，通?？梢蕴娲鷧捬跆墙徒狻５蠖鄶?shù)活細胞成像實驗并不需要嚴格的O2調(diào)控。有趣的是，氧氣的消耗經(jīng)常被用作一種策略，以減少通過與活性氧的反應而發(fā)生的光損傷。這一策略可能涉及氧氣消耗系統(tǒng)，如氧化酶或抗氧化劑，如維生素C，以限制自由基的損害。然而，在某些情況下，O2張力降低可能導致缺氧應激，這對細胞是有危險的。

大多數(shù)細胞系在260 ~ 320 mosM的滲透壓值范圍內(nèi)高效生長。當添加HEPES來改變培養(yǎng)基組分時，監(jiān)測培養(yǎng)基的滲透壓是很重要的。大多數(shù)成像室容納小體積，在培養(yǎng)基溫度較高時，由于蒸發(fā)作用，滲透壓會發(fā)生變化。在大多數(shù)情況下，顯微鏡有一個二氧化碳控制的孵育室，用于在37攝氏度下處理哺乳動物細胞。低滲培養(yǎng)基可以在培養(yǎng)皿中常規(guī)替代，以補償蒸發(fā)。也可以通過將培養(yǎng)基密封在一個開放的機油室或通過控制濕度來最小化蒸發(fā)。

在短期研究中應用大體積培養(yǎng)基可以避免由于蒸發(fā)而造成的滲透壓和O2的偏差。長期研究可采用加熱機組、加濕器孵育室、碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)相結(jié)合的方式對環(huán)境參數(shù)進行控制。

為了更好地解釋活體細胞成像實驗的結(jié)果，通常采用先進的寬視野和共聚焦顯微鏡技術(shù)。例如，細胞的生長和發(fā)育是在相位對比和差分干涉對比(DIC)顯微鏡下觀察的，但發(fā)育胚胎研究有時更傾向于在立體顯微鏡下觀察。另一方面，熒光技術(shù)被用來標記特定的細胞化合物，使它們在共聚焦顯微鏡下更容易觀察到。然而，活細胞成像系統(tǒng)被限制在一定的最佳條件下，以確保細胞保持在健康的狀態(tài)。