干貨分享|怎么跳出WB設下的陷阱

前段時間小編給大家分享了WB/ELISA/IHC三大實驗的內(nèi)容，今天小編就來給大家簡要梳理一些WB流程中的一些細節(jié)，避免因某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)差錯而導致實驗重做。

做蛋白研究的小伙伴都知道，一個完整的Western Blot包括了很多個步驟，從蛋白提取到配膠、上樣電泳，再到轉(zhuǎn)膜、封閉，最后孵育一抗二抗后才能去進行檢測。時間跨度非常長，而且這中間的每一步都包含了很多的小細節(jié)，稍有不慎就會導致結果出錯，然后又得從頭來過。所以，關于WB，幾乎每一位經(jīng)驗豐富的實驗老手都有著一本厚厚的血淚史。

一：樣品的獲取與制備

一般來說我們檢測的樣本主要為細胞或者組織，制備的過程中盡量保持低溫，其次在制備時一定要根據(jù)目的蛋白的特性選擇合適的裂解液，比如對膜蛋白的提取、胞漿蛋白的提取和組織蛋白的提取等。

二：配膠、上樣及蛋白電泳

配膠前將玻璃清洗干凈烘干（用紙巾擦干/有時間50°C烘干）。晾干后根據(jù)蛋白分子量進行不同濃度凝膠配制，上樣是需要把蛋白進行煮沸變性，如果進行定量分析一定要將所有蛋白上樣量調(diào)制相同，電泳時低壓（80V）跑濃縮膠，高壓（120v）跑分離膠，至溴酚藍即將跑出膠面時終止電泳。

三：轉(zhuǎn)膜及封閉

膜的選擇主要從實驗目的和實驗要求來考慮。例如，要做分子量小于20kD的小蛋白，0.45μm的NC膜是不可取的，因為這樣可能會使得蛋白因透過膜孔而造成膜結合的目的蛋白量不確定，從而影響到最終結果的可靠性。而如果所分離的蛋白需要進行測序，則非PVDF膜不可，因為只有PVDF膜才能經(jīng)受住嚴酷的清洗條件。

建議轉(zhuǎn)移之后迅速在 Tris-Buffered Saline (TBS) 中洗滌膜，以便移除殘留的轉(zhuǎn)移緩沖液，隨后在室溫條件下含5% 脫脂牛奶的 Tris Buffered Saline 和 Tween® 20 去污劑 (TBST)中封閉1小時。這一封閉步驟有助于降低非特異性一抗結合并降低背景。應避免膜封閉時間過長，因為這會掩蓋抗原表位，阻止抗體結合。封閉后在TBST 中洗滌5分鐘。

四：抗體的孵育和檢測

抗體孵育：目的蛋白印跡在膜上，經(jīng)過封閉之后，印跡目的蛋白與一個或多個抗體孵育。第一個抗體（一抗）與目的蛋白結合，而第二個抗體（二抗）與第一個抗體結合，二抗本身結合有酶或染料，可用來指示蛋白的位置。不過有些一抗也具有直接標記的功能，但使用標記二抗有明顯優(yōu)勢。首先不止一個二抗分子能與單個一抗分子結合，形成信號；其次，標記的二抗可用于大量不同特異性的一抗，因而無需標記多個一抗。

直接western blot檢測方法：在直接檢測方法中，酶直接連接到一抗上。操作簡單，檢測步驟少。雖然直接檢測是快速和直接的，但它往往比間接檢測的靈敏度低，因為在這個過程中可以發(fā)生信號放大的步驟更少。此外，酶直接標記到一抗上可能會造成成本和資源上的限制。

間接western blot檢測方法：間接檢測方法比直接檢測方法更受歡迎，主要是靈敏度更高。通過間接檢測，識別感興趣的抗原的抗體，稱為一抗，檢測是通過添加標記的二抗實現(xiàn)的，二抗可以識別一抗上的特定表位。這種表位通常是種屬特異性的；例如，在兔體內(nèi)產(chǎn)生的幾種不同的一抗都可以被同一種抗兔二抗體所識別。