不會感受態(tài)細(xì)胞制備的 看過來啦

1.什么是感受態(tài)細(xì)胞

（1）感受態(tài)細(xì)胞其實是一種暫時性改變一下細(xì)胞膜的通透性，以利于外源DNA（如質(zhì)粒）進入細(xì)胞。這樣的活細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。

（2）主要原理其實就是通過特殊的方法處理使細(xì)胞，使細(xì)胞膜的通透性變大，直觀的說，使得細(xì)胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞，便于外源DNA（如重組質(zhì)?；蛘哌\載體）進入感受態(tài)的細(xì)胞。

2.
感受態(tài)細(xì)胞制備原理在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)之一。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如:電擊法，CaC12等化學(xué)試劑法)處理后，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過的感受態(tài)細(xì)胞。進入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。

常見的感受態(tài)細(xì)胞的制備方法一般有：化學(xué)制備法和物理制備法

3.化學(xué)制備法大腸桿菌的轉(zhuǎn)化常用化學(xué)法(CaCl2法)，該法先是由Cohen于1972年發(fā)現(xiàn)的。其原理是細(xì)菌ACaC12的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物,在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值，被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中,重組子中基因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。
Ca2+處理的感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率一般能達到

5×106~2×107轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒DNA，可以滿足一般的基因克隆試驗。如在Ca2+的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其它的二價金屬離子(Mn2+、Co2+)、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，則可使轉(zhuǎn)化率提高100~1000倍。

化學(xué)法簡單、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好，菌株適用范圍廣，感受態(tài)細(xì)菌可以在-70C保存，因此被廣泛用于外源基因的轉(zhuǎn)化。

4.物理制備法電轉(zhuǎn)法（原理待續(xù)除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外，還有電擊轉(zhuǎn)化法，電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài)，依靠短暫的電擊，促使DNA進入細(xì)菌，轉(zhuǎn)化率最高能達到109~1010轉(zhuǎn)化子/ug閉環(huán)DNA。因操作簡便，愈來愈為人們所接受）5.感受態(tài)細(xì)胞制備具體步驟1. 從 37 ℃ 培養(yǎng) 16～20 h 的平板中挑取一個單菌落（直徑 2～3 mm），轉(zhuǎn)到一個含有 100 ml LB 或 SOB 培養(yǎng)基的 1L 燒瓶中。于 37℃ 劇烈振搖培養(yǎng) 3 h。一般經(jīng)驗，1 OD600 約含有大腸桿菌 DH5α 109個/mL。

2. 將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放置 10 min，使培養(yǎng)物冷卻至 0℃。

3. 于 4 ℃ 用 Sorvall GS3 特頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以 4 100 r/min 離心 10 min，以回收細(xì)胞。

4. 倒出培養(yǎng)液，將管倒置 1 min 以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。

5. 每 50 ml 初始培養(yǎng)液用 30 ml 預(yù)冷的 0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液（80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2）重懸每份細(xì)胞沉淀。

6. 于 4 ℃ 用 Sorvall GS3 轉(zhuǎn)頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以 4 100 r/min 離心 10 min，以回收細(xì)胞。

7. 倒出培養(yǎng)液，將管倒置 1 min 以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。

8. 每 50 ml 初始培養(yǎng)物用 2 ml 用冰預(yù)冷的 0.1 mol/L CaCl2（或 TFB） 重懸每份細(xì)胞沉淀。

9. 此時，可以用新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞直接做轉(zhuǎn)化實驗，也可以將細(xì)胞凍存于- 70 ℃。

6.感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化的影響因素（1）、細(xì)胞的生長狀態(tài)和密度

最好從-70℃或-20°C甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4℃的培養(yǎng)菌液。細(xì)胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107個左右為佳。即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細(xì)菌，可通過測定培養(yǎng)液的OD600控制。對TG1菌株，OD600為0．5時，細(xì)胞密度在5×107個/ml左右。(應(yīng)注意OD600值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同)。密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。

此外，受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。

(2)、質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度

用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉(zhuǎn)化率下降。一般地，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞達到飽和。

對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實驗證明，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進行轉(zhuǎn)化。此外，重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10~100倍，因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。

(3)、試劑的質(zhì)量

所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4°C。

(4)、防止雜菌和雜DNA的污染

整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。

(5)、整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會降低。