恒溫水浴箱對人血漿中鹽酸克侖特羅濃度的測定

鹽酸克侖特羅（ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ,ＣＬ）,又名氨哮素、瘦肉精、雙氯醇胺等,化學(xué)名為α [（叔丁氨基）甲基] 4 氨基 3,5 二氯苯甲醇鹽酸鹽,是一種β2 受體激動藥。其松弛支氣管平滑肌作用強而持久,臨床上主要用于治療支氣管哮喘。由于藥物半衰期長,在體內(nèi)代謝慢,臨床應(yīng)用時,可能出現(xiàn)肌肉震顫、心慌、心悸、頭疼、惡心、嘔吐等癥狀,特別是對于高血壓、心臟病、甲亢、青光眼、前列腺肥大等疾病患者危險性較大,可能會加重病情,導(dǎo)致意外,所以對ＣＬ的臨床血藥濃度監(jiān)測非常重要。本實驗采用ＨＰＬＣ-電化學(xué)法測定ＣＬ血藥濃度,參考有關(guān)資料,著重對人血漿中ＣＬ的提取方法、色譜條件、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇以及方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性等進行了研究,并對患者血漿樣本進行分析。
1材料
1.1儀器　
　　島津ＬＣ 6Ａ液相色譜儀,ＬＥＤ 6Ａ電化學(xué)檢測器,ＪＳ 3030色譜工作站,超聲波儀,恒溫水浴箱（上海和呈儀器生產(chǎn)）,高速離心機。
1.2藥品與試劑　
　　鹽酸克侖特羅對照品（新鄉(xiāng)同心制藥廠,批號20030601,純度98.7%）,乙腈（色譜純）,辛基磺酸鈉（Ｓｉｇｍａ）,其余試劑均為分析純。ＣＬ對照品和對苯二酚內(nèi)標(biāo)均用0.02ｍｏｌ?Ｌ-1ＨＣｌ配制成標(biāo)準(zhǔn)儲備液。
2方法與結(jié)果
2.1色譜條件　
　　色譜柱:ＮｕｃｌｅｏｄｕｒＣ18（250ｍｍ×4.6ｍｍ,10μｍ）;流動相:磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈=7∶3（Ｖ/Ｖ）;磷酸二氫鉀緩沖液內(nèi)含0.02ｍｏｌ?Ｌ-1磷酸二氫鉀,0.15ｍｍｏｌ?Ｌ-1Ｎａ2ＥＤＴＡ,0.2ｍｍｏｌ?Ｌ-1辛基磺酸鈉,ｐＨ5.0,并通過0.45μｍ的濾膜過濾后與乙腈按比例混合,流速1.2ｍＬ?ｍｉｎ-1,檢測器電位0.80Ｖ（Ａｇ/ＡｇＣｌ電極）,進樣量20μＬ。
2.2血漿樣本的處理
取15ｍＬ離心試管依次加入0.2ｍｏｌ?Ｌ-1ＮａＯＨ溶液2ｍＬ,0.5ｍｇ?Ｌ-1對苯二酚內(nèi)標(biāo)液100μＬ,肝素抗凝血漿樣本1ｍＬ,混勻,加乙醚-乙醇（8∶2）提取液8ｍＬ,封蓋,用超聲波儀提取20ｍｉｎ,3000ｒ?ｍｉｎ-1離心15ｍｉｎ;取上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈試管中,加入0 .2ｍｏｌ?Ｌ-1ＮａＯＨ2ｍＬ混勻洗滌,3000ｒ?ｍｉｎ-1離心5ｍｉｎ,取上清液層轉(zhuǎn)移至一潔凈試管中,置60℃水浴上通Ｎ2揮干,殘留用0.1ｍＬ流動相重組后,取20μＬ供液相色譜儀測定,用內(nèi)標(biāo)法以峰面積定量。
2.3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗
通過對流動相的配比、ｐＨ、流速、檢測電位的調(diào)整實驗,確定在上述色譜條件下,空白血漿加內(nèi)標(biāo)及ＣＬ對照品的測試結(jié)果見圖1。內(nèi)標(biāo)及ＣＬ保留時間分別為4.975、5.652ｍｉｎ。兩者分離度>5,達到基線分離,且無空白干擾。

　　

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制　
　　取空白血漿7份,每份1ｍＬ,各加入100μＬ內(nèi)標(biāo)液,分別加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液使之配成5、10、20、40、60、100、120μｇ?Ｌ-1的標(biāo)準(zhǔn)系列;按2.2項下操作測定,由色譜工作站直接求出ＣＬ對內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Ｙ）與相應(yīng)的濃度比值（Ｘ）的回歸方程,Ｙ=0.753Ｘ+0.011,ｒ=0.9993。檢出限為0.015μｇ?Ｌ-1（ｒＳＮ=3）,線性范圍為1.5～120μｇ?Ｌ-1。
2.5回收率和精密度的測定　
　　對高、中、低3份ＣＬ含量為5、20、40μｇ?Ｌ-1的標(biāo)準(zhǔn)血樣分別按本法檢測,其回收率分別為90.5%、94.7%、96.3%,平均為93.8%。同時3份樣本按本法分別平行檢測5次,ＲＳＤ分別為2.6%、3.7%、4.2%。
2.6樣品測定
我們采用該方法測定了3例患者口服ＣＬ后的血藥濃度,患者每次口服該藥30μｇ,服藥后2.5ｈ和24ｈ靜脈取血。結(jié)果見表1。

　　

3討論
　　國內(nèi)外文獻報道的ＨＰＬＣ法測定生物樣本ＣＬ的前處理方法中,采用乙醚-丁醇、己烷-乙酸乙酯等溶劑體系,提取回收率均偏低,影響檢測靈敏度。因為鹽酸克侖特羅在中性、酸性下易溶于水、甲醇、乙醇,不溶于乙醚等,而在堿性下可溶于乙醚。本實驗在堿性條件下用乙醚∶乙醇混合比分別為6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的4種混合提取液對同一份加標(biāo)樣品,各作3次平行對比測定。其平均回收率分別90.6%、92.2%、95.3%、93.6%。結(jié)果表明乙醚∶乙醇混合比8∶2作提取液時,其結(jié)果*。
　　本法處理樣品簡單,測定準(zhǔn)確、快速,采用電化學(xué)檢測器檢測,專屬性強,靈敏度高,且不受其他藥物的干擾,更適用于臨床鹽酸克侖特羅血藥濃度的監(jiān)測。