質(zhì)譜成像技術(shù)揭示板藍(lán)根中化學(xué)成分的空間分布

板藍(lán)根（Isatidis Radix）為十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán)（Isatis indigotica Fortune）的干燥根，具有清熱、解毒、涼血、利咽等功效。作為清熱解毒類的代表藥物，板藍(lán)根與廣泛用于各類感冒的預(yù)防和治療，在嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）、甲型H1N1流感等疾病的防治中發(fā)揮了積極作用。新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）爆發(fā)以來，各版《診療方案》和“三藥三方”中也不乏板藍(lán)根的身影。板藍(lán)根的抗病毒抗炎藥效顯著，但化學(xué)成分復(fù)雜，質(zhì)量評(píng)價(jià)難度較高，因而一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

目前研究學(xué)者已經(jīng)從板藍(lán)根中分離得到近400個(gè)化合物，綜合文獻(xiàn)報(bào)道主要可歸納為生物堿、含硫化合物、苯丙素、核苷、氨基酸、有機(jī)酸、酚、黃酮、蒽醌、萜、醇、醛、酮、腈、酯、糖、甾醇、肽、鞘脂等19大類。研究藥用植物化學(xué)成分的空間分布，有助于了解其形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和功能。盡管板藍(lán)根的化學(xué)成分研究已經(jīng)十分深入，但其分子空間分布鮮見報(bào)道。質(zhì)譜成像（mass spectrometry imaging，MSI）技術(shù)是近年新興的分子成像技術(shù)，通過直接測(cè)定樣品表面的離子信號(hào)獲得其空間分布信息，具有非靶向、無需標(biāo)記和多成分同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。與光學(xué)圖像采集技術(shù)結(jié)合后，既可觀察到高分辨率的形態(tài)圖像，又可對(duì)特定的分子進(jìn)行鑒定和可視化分布分析，在生命科學(xué)領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用前景。本文采用高分辨質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)板藍(lán)根化學(xué)成分的空間分布進(jìn)行分析。利用大氣壓基質(zhì)輔助激光解吸電離-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜（atmospheric pressure matrix assisted laser desorption combined with ion trap-time-of-flight mass spectrometry，AP-MALDI-IT-TOF/MS）掃描不同產(chǎn)地藥材橫切面，鑒定所含化合物，并觀察化合物空間分布模式和富集位置，結(jié)合偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）算法，對(duì)不同樣品進(jìn)行分類。研究思路見圖1。

圖1 AP-MALDI-IT-TOF/MS成像技術(shù)揭示板藍(lán)根中化學(xué)成分的空間分布

1. iMScope TRIO 成像質(zhì)譜顯微鏡測(cè)試條件

質(zhì)譜成像技術(shù)在植物、動(dòng)物、人體組織中的內(nèi)源性成分和藥物代謝組分的可視化檢測(cè)方面發(fā)展迅猛，但在中藥分析領(lǐng)域的應(yīng)用才剛開始起步，且多用于新鮮采集的原植物或中藥材。而真正用于市場(chǎng)流通和臨床應(yīng)用的中藥材為干品，制備滿足MSI測(cè)試需要的切片比較困難，故相關(guān)研究鮮見報(bào)道。在制備板藍(lán)根干品冰凍切片時(shí)，其干燥、堅(jiān)硬、易碎的結(jié)構(gòu)帶來了極大的挑戰(zhàn)，故對(duì)冷凍切片的厚度、溫度，切片固定方式，基質(zhì)種類和添加方式等進(jìn)行了詳細(xì)的優(yōu)化。板藍(lán)根藥材經(jīng)明膠包裹冷凍后，先用雙面碳導(dǎo)電膠貼牢后，再用冰凍切片機(jī)切制40 μm的組織切片，分別噴涂2, 5-DHAP溶液和1, 5-DAN溶液作為正、負(fù)離子的基質(zhì)。主要質(zhì)譜條件如下：激光照射直徑：40 μm，像素間隔80 μm，掃描范圍：m/z 100-500，m/z 500-1000。

2. 板藍(lán)根中化合物的AP-MALDI-IT-TOF MSI可視化分布

根據(jù)離子的準(zhǔn)確質(zhì)荷比、同位素豐度比，與對(duì)照品和液質(zhì)一、二級(jí)數(shù)據(jù)比對(duì)，并結(jié)合文獻(xiàn)檢索和數(shù)據(jù)庫搜查，初步鑒定了多個(gè)化合物類別118個(gè)質(zhì)譜峰（見圖2）。成像質(zhì)譜顯微鏡將光學(xué)顯微鏡和質(zhì)譜儀的優(yōu)勢(shì)整合，既可觀察到形態(tài)圖像，又可對(duì)分子進(jìn)行鑒定和可視化分布分析，在軟件上可簡(jiǎn)便且高精度地重疊觀察光學(xué)顯微鏡圖像與質(zhì)譜分析圖像，詳細(xì)解析感興趣區(qū)域。本文采用AP-MALDI-IT-TOF MSI技術(shù)揭示了板藍(lán)根中化合物的空間分布， 圖3和 圖4展示了板藍(lán)根橫切面的木栓層、皮層、韌皮部、形成層、木質(zhì)部及部分化合物在特定空間區(qū)域的分布。綜合分析，板藍(lán)根中化合物大多富集于營養(yǎng)儲(chǔ)存的組織韌皮部，與之相比，水分輸送組織木質(zhì)部中集中分布的成分較少。

圖2 板藍(lán)根MALDI-IT-TOF MS成像化合物鑒別結(jié)果

圖3 板藍(lán)根橫切面光學(xué)圖 (a) 和oxindole (b)、3-[2'-(5'-hydroxymethyl) furyl]-1(2H)-isoquinolinone-7-O-β-D-glucoside (c)、coniferin (d)、guanine (e)、histidine (f)、 proline (g)、arginine (h)、cyclo(L-Phe-L-Tyr) (i)等成分正離子質(zhì)譜成像圖

圖4 板藍(lán)根橫切面光學(xué)圖 (a) 和 isatindigoside F (b)、clemastanin B (c)、maleic acid (d)、malic acid (e)、citric acid (f)、sucrose (g)、isovitexin (h)、vanillin (i) 等成分負(fù)離子質(zhì)譜成像圖

3. PLSR法區(qū)分不同產(chǎn)地板藍(lán)根藥材

將4個(gè)產(chǎn)地的各3批板藍(lán)根藥材分別劃分到4個(gè)組。以樣品橫切面的AP-MALIDI-IT-TOF MSI數(shù)據(jù)為Y值，組別為X值，在正、負(fù)離子模式和m/z 100-500、m/z 500-1000兩個(gè)掃描范圍內(nèi)，分別建立PLSR回歸模型。由圖5可見，在4個(gè)模型中，樣品規(guī)格的預(yù)測(cè)值和實(shí)際值均呈現(xiàn)良好的相關(guān)關(guān)系，說明采用PLSR法可對(duì)不同產(chǎn)地的板藍(lán)根進(jìn)行準(zhǔn)確的區(qū)分。

圖5 MALDI-IT-TOF MS成像結(jié)合PLSR回歸區(qū)分不同產(chǎn)地板藍(lán)根樣品

正離子m/z 100-500范圍 (A)、負(fù)離子m/z 100-500范圍 (B)、正離子m/z 500-1000范圍(C)、負(fù)離子m/z 500-1000范圍 (D)

本文相關(guān)內(nèi)容由中國食品藥品檢定研究院的聶黎行研究員提供，詳細(xì)研究?jī)?nèi)容已正式發(fā)表于Frontiers in Pharmacology - Ethnopharmacology, 2021, https://doi.org/10.3389/fphar.2021.685575。

文獻(xiàn)題目

《Microscopic Mass Spectrometry Imaging Reveals the Distributions of Phytochemicals in the Dried Root of Isatis indigotica》

使用儀器

島津iMScope TRIO

作者

Li-Xing Nie1,2, Jing Dong3, Lie-Yan Huang2, Xiu-Yu Qian2, Shuai Kang2,4*, Zhong Dai2 and Shuang-Cheng Ma1,2*

1 Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing, China

2 National Institutes for Food and Drug Control, National Medical Products Administration, Beijing, China

3 Shimadzu China Innovation Center, Beijing, China

4 College of Pharmacy, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang, China