提高HPLC檢測限、溶劑脫氣等的幾點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)

僅針對用反相碳十八烷基硅烷化填料的柱子和紫外檢測器的HPLC

通常在理論教學(xué)時，HPLC分析總要求實(shí)用HPLC純的試劑、用孔徑比填料粒度小的微孔濾膜過濾流動相、用真空或氦氣脫氣。實(shí)際上，按照不同的度，有時候并不需要做得那么嚴(yán)格。這里首先申明，雖然許多做法是我的經(jīng)驗(yàn)，但請讀到這篇文章的朋友自己做個判斷，如果按我說的做，造成任何損失，我深表遺憾，但我不承擔(dān)任何責(zé)任。這篇文章僅供交流和討論。

     關(guān)于HPLC純。我想這里關(guān)鍵是兩點(diǎn)：純度高、紫外吸收小。純度高一方面，沒有雜質(zhì)干擾測定；另一方面不會有金屬離子損害純度為99.99%以上的高純度硅膠基質(zhì)。但如果你的HPLC分析的是直接用分析純試劑制備而沒有其他色譜純?nèi)軇┫♂尣襟E而且是中藥之類的dirty sample（臟樣品）；那么用自己重蒸的分析純?nèi)軇┮部梢粤耍?dāng)然還有一點(diǎn)是紫外吸收也要同時符合要求。這對于黃芩苷一類含量高、紫外吸收大的樣品足夠了。如果懶得自己重蒸，也可以用些便宜的色譜純試劑。事實(shí)上，據(jù)我所知，許多所謂的色譜純也是國內(nèi)制備灌國外品牌的瓶子賣的。水嘛，用去離子水就行了，也就是市售的純水。水的紫外吸收與甲醇、乙腈相比，小得很，主要考慮不要有金屬離子和細(xì)菌。不過，千萬別買了假的純水。保險(xiǎn)做法，找家大的純水供應(yīng)點(diǎn)，買水回來，做一下紫外掃描、做下菌檢、再來個水硬度檢查，行的話就固定用他的。

    濾膜過濾，除非是無機(jī)鹽，否則我均不過濾，定期把前置的過濾頭取下，放稀硝酸里清洗，再用純水洗至中性就行了。能過過濾頭的東西就讓它過吧，懶得理它，有人可能會考慮堵塞的問題，沒等它堵，我的柱子都會壞了，把柱子前面一點(diǎn)挖了，添上新的，就行了，當(dāng)然這里操作要小心。至于長菌，能在甲醇里長，我也沒辦法了。

    如果是高壓二元梯度泵，用超聲脫氣就行了。把溶劑瓶放到59kz的超聲清洗機(jī)超至沒有白白的氣泡上來就行了。四元的是混合后脫氣，比較重要，一般都會配脫氣機(jī)，我也沒用過，不說了。如果是要求檢測限很小的分析，有幾點(diǎn)建議，首先，如果是等度洗脫，一定要改成單元等度，即流動相混合到一個瓶子里；第二，盡量用乙腈/水系統(tǒng)洗脫，乙腈紫外吸收小，相同條件下，噪音小很多；在前兩樣都解決不了，那只好通氦脫氣了。梯度洗脫，如果像人參皂苷之類的，盡量用乙腈/水系統(tǒng)洗脫，不行就通氦啰。

    做了那么久液相，堵塞流路的事情碰過幾回，都是無機(jī)鹽配的緩沖液惹禍，都不關(guān)過濾的事。緩沖液換有機(jī)相沖柱時，有人一不注意沒沖干凈無機(jī)鹽就沖甲醇，結(jié)果就塞了。千萬要用90%左右的水先沖干凈鹽。不銹鋼管路堵了好辦，烘箱烘之，再沖開。柱子堵了，我還沒試過。

    其實(shí)，做HPLC通常擔(dān)心的是做不出理想的結(jié)果和壞柱子。
理想的結(jié)果，主要的就靠流速的和檢測限。流速才能保證保留時間，這與機(jī)器性能有關(guān)，不談了。檢測限越低就等于色譜峰可以的誤差可以越小。根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，二元等度會使噪音峰高大大增加，所以做等度不要用二元，除非，你的樣品峰高遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于噪音（20倍以上吧）。可以的話，使用乙腈自然比甲醇好?？諝獾拇嬖谝矔绊懺胍?，甚至是出鬼峰，還是那句，不行就通氦啰。additives（添加劑）也要注意，看看添加的三乙胺、乙酸之類的截止波長是多少，低于她的截止波長就是不透過，會極大的增大噪音。
噪音是怎樣造成的呢，就是往復(fù)泵的脈沖和流動相的基礎(chǔ)吸收，用單元泵是為了降低脈沖；用乙腈就是降低基礎(chǔ)吸收。物質(zhì)的紫外吸收系數(shù)一般是固定的，降低噪音提高檢測限的出發(fā)點(diǎn)就是以上兩方面了。但是物質(zhì)在不同的溶劑里，紫外吸收系數(shù)是不一樣的，有時候添加劑也會影響，特別是酸，乙酸、磷酸、鹽酸有時候值得選擇一下。

    保護(hù)柱子，就是不要堵了，不要污染。我一般不用保護(hù)柱，得不償失，國內(nèi)的不能用，國外得太貴。我就兩招：用3%乙酸溶液和甲醇二元梯度100%甲醇到10%甲醇，一小時做個來回，柱子耐不了pH10的就用1%乙酸，這東西，降柱壓有奇效，目前為止我是百試百靈；另一招就是挖柱填柱了。