基于葉綠素 ａ測定的分光光度法與 ｂｂｅ法比較：以千島湖為例

   葉綠素 ａ是所有浮游植物中均含有的主要吸光 色素，其含量通常用來估量浮游植物的生物量和初級生產(chǎn)力，反 映水體的營養(yǎng)狀況和作為水體富營養(yǎng)狀況評價(jià)中的 關(guān)鍵參數(shù)監(jiān)測水體葉綠素 ａ對 了解水環(huán)境質(zhì)量現(xiàn)狀及演變趨勢具有重要意義。因 此，建立一種操作簡單和結(jié)果準(zhǔn)確的葉綠素 ａ測定 方法很必要。

   浮游植物葉綠素的測定方法主要有分光光度法 、熒光法和高 效液相色譜法。熒光法具有高 效、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，高效液相色譜法可以同時(shí)測定多種 色素且結(jié)果更準(zhǔn)確，但這 ２種 方法所需儀器價(jià)格昂貴且操作復(fù)雜，難以作為常規(guī) 的監(jiān)測方法。分光光度法具有操作簡便、可靠性強(qiáng) 的特點(diǎn)而被廣泛采用 。其他葉綠素 ａ測定方法還 包括水色傳感器 ＳｅａＷｉＰＳ遙感法和機(jī)載海洋激光雷達(dá)法。這些方法 中有些已經(jīng)使用了幾十年，優(yōu)點(diǎn)是可以充分將藻類 細(xì)胞壁破碎，對葉綠素的提取速度快、效率高，但是 采集樣品過程需要按照一定的程序進(jìn)行，樣品的需 求量較大，在貯存、運(yùn)輸?shù)倪^程中樣品中葉綠素 ａ的含量可能發(fā)生變化，在研磨過程中葉綠素 ａ容易發(fā) 生光降解使結(jié)果偏低，而且提取過程操作繁瑣，轉(zhuǎn)移 過程中人為誤差較大，導(dǎo)致葉綠素 ａ含量的測定結(jié) 果與水體實(shí)際含量存在一定的偏差。此外，研磨過程需花費(fèi)較多 的時(shí)間和精力，與丙酮的接觸時(shí)間長，不利于操作人 員的健康。在實(shí)際操作中，人們 已認(rèn)識到丙酮 －研磨法存在的缺點(diǎn)，并從多方面如 提取液、提取方式、提取溫度和提取時(shí)間等進(jìn)行改進(jìn)。

   ｂｂｅ藻類現(xiàn)場分析儀是德國 ｂｂｅ公司基于葉綠素的熒光反應(yīng)特征研制的能潛入水體中快速檢測葉綠素濃度的 儀器。ｂｂｅ藻類現(xiàn)場分析儀能 快速檢測最深 １００ｍ處的葉綠素濃度，檢測數(shù)據(jù)可 以通過串口在線顯示或者存儲在設(shè)備中等待后續(xù)分 析。除檢測葉綠素含量，該儀器還可以檢測到藻的 存在，并將藻按光譜分類（藍(lán)藻／青藍(lán)菌藻、綠藻、硅 藻／甲藻、隱藻）。在國外，利用 ｂｂｅ-ＦｌｕｏｒｏＰｒｏｂ檢 測分析藻類 （以下簡稱 ｂｂｅ法）應(yīng)用較為廣泛， 利用 ｂｂｅ法現(xiàn)場分析儀檢測 水庫浮游植物群落的組成及其動(dòng)態(tài)變化，利用 ｂｂｅ法監(jiān)測水體的藻類并預(yù)測 藍(lán)藻暴發(fā)，比較 了不同方法測定葉綠素 ａ結(jié)果，ｂｂｅ法測定結(jié)果與 其他方法測定結(jié)果相關(guān)性較高。我們于 ２００９年７月至２０１０年 ６月，在大型深水型水庫———千島湖分 別使用分光光度法和 ｂｂｅ法測定水體的葉綠素 ａ濃度，驗(yàn)證二者測定結(jié)果的相關(guān)性，以期能找出結(jié)果更 精確、使用更方便的葉綠素 ａ測定方法。

１ 材料與方法

1.1 樣點(diǎn)設(shè)置

   新安江是千島湖最主要的入庫地表徑流，同時(shí) 是千島湖營養(yǎng)鹽主要的源頭。新安江大壩是千島湖 水流出口。根據(jù)千島湖的水體形態(tài)、水流等特點(diǎn)，從 上游至下游設(shè)置 ３個(gè)采樣點(diǎn)（圖 １、表 １），分別位于 千島湖的西北、中心和東南湖區(qū)。其中 Ｓ１點(diǎn)屬于上 游河流區(qū)，流速較快，泥沙含量較大，水體渾濁；Ｓ４ 點(diǎn)位于中游過渡區(qū)，流速較緩，水體較為平靜，水體 較為清澈，藻類生物量較高；Ｓ９點(diǎn)位于下游靜水區(qū)， 水體最為平靜且浮游動(dòng)物較多，水體較為清澈。

1.2分光光度法測定 

   水樣采集在每月中旬進(jìn)行。根據(jù)各采樣點(diǎn)水深 情況，對各點(diǎn)水樣進(jìn)行相應(yīng)的分層采集。其中，Ｓ１ 按照 ０．５、４、８、１２、１６、２０和 ２５ｍ等水層依次采集； Ｓ４按照 ０．５、４、８、１２、１６、２０、２５和 ３０ｍ等水層依次 采集；Ｓ９按照 ０．５、４、８、１２、１６、２０、２５、３０、３５、４０、４５ 和 ５０ｍ等水層依次采集。采樣方法和葉綠素 ａ的 測定按金相燦等（１９９０）方法進(jìn)行。

1.3 ｂｂｅ法測定

   與分光光度法的水樣采集同時(shí)進(jìn)行。使用前， 先將儀器置于水體表層，完成對深度的校準(zhǔn)。校準(zhǔn) 完畢后，啟動(dòng)儀器的測量功能，勻速釋放線纜，電腦 會自動(dòng)記錄測量的各項(xiàng)指標(biāo)，當(dāng)水深達(dá)到預(yù)定測量 水深時(shí)，停止測量，保存數(shù)據(jù)。

２ 結(jié)果與分析

2.1全湖葉綠素 ａ測定

   成對 Ｔ檢驗(yàn)表明，分光光度法測定得到的葉綠 素 ａ含量顯著高于 ｂｂｅ法的測定結(jié)果（表 ２）。對 ２ 種方法測得的全湖全年的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā) 現(xiàn)二者存在極顯著的相關(guān)關(guān)系（ｒ＝０．８３，ｎ＝２９３， Ｐ＜０．０１），但個(gè)別數(shù)據(jù)差異較大（圖 ２）。將分光光 度法測定的葉綠素 ａ濃度劃分為 ３個(gè)濃度組，分別 與 ｂｂｅ法測定葉綠素 ａ進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果表明， 低濃度組（＜３μｇ／Ｌ）、中濃度組（３～１２μｇ／Ｌ）的相 關(guān)系數(shù)分別為 ０．４５２（Ｐ＜０．００１，ｎ＝２５０）和 ０．６８２ （Ｐ＜０．００１，ｎ＝４２），高濃度組（＞１２μｇ／Ｌ）僅 １對 樣本，未進(jìn)行相關(guān)分析。

2.2 相同月份葉綠素 ａ測定 

   相同月份葉綠素 ａ測定結(jié)果見圖 ３。２種方法 測定出的葉綠素 ａ的最大值、最小值都是出現(xiàn)在相 同的月份。偏相關(guān)分  析表明，２種方法測定的葉綠 素 ａ的月份變化較為一致，偏相關(guān)系數(shù)站點(diǎn) Ｓ１為 ０．８４１（Ｐ＜０．００１），Ｓ４為 ０．８５２（Ｐ＜０．００１），Ｓ９為 ０．７７８（Ｐ＜０．００１）。

2.3 相同深度葉綠素 ａ測定 

   相同深度葉綠素 ａ測定結(jié)果見圖 ４。２種方法 測出葉綠素 ａ的濃度在各采樣點(diǎn)的垂直變化趨勢一 致，表層水中的葉綠素 ａ濃度最高，基本上都是隨著 深度的增加葉綠素 ａ濃度逐漸降低，即水深越深，葉 綠素 ａ濃度越低。偏相關(guān)分析表明，２種方法測定８１ ２０１３年第 ２期 周 靜等，基于葉綠素 ａ測定的分光光度法與 ｂｂｅ法比較：以千島湖為例的葉綠素 ａ的垂直變化趨勢也較為一致，偏相關(guān)系 數(shù) Ｓ１ 點(diǎn) 為 ０．７９９（Ｐ＜０．００１），Ｓ４ 點(diǎn) 為 ０．８１３（Ｐ＜０．００１），Ｓ９為 ０．６６６（Ｐ＜０．００１）。

３ 討論

3.1ｂｂｅ法數(shù)據(jù)低于分光光度法的原因

   分析發(fā)現(xiàn)，我國通用的標(biāo)準(zhǔn)分光光度法與國際 上運(yùn)用較多的 ｂｂｅ法測定得到的葉綠素 ａ含量顯著 相關(guān)，但后者比前者普遍偏小。分光光度法在葉綠 素 ａ提取過程中，如果使用塑料材質(zhì)的離心管提取 葉綠素 ａ（丙酮對塑料具有腐蝕作用）或者冷藏時(shí)間 過長，測定的藻類葉綠素 ａ值都會偏大，本文采用塑料材質(zhì)的離心管進(jìn)行提取，從而 導(dǎo)致結(jié)果偏高。本研究采用的 ｂｂｅ法是根據(jù)高效液 相色譜（ＨＰＬＣ）分析的校準(zhǔn)參數(shù)對葉綠素 ａ含量進(jìn) 行定量的。葉綠素 ａ樣品中含 有一些異質(zhì)同晶體和其他葉綠素衍生物，分光光度 法能在 ６６５ｎｍ光譜下檢測出這些物質(zhì)，并將其作為 葉綠素 ａ的一部分；但 ｂｂｅ能識別這些物質(zhì)，未將其 作為葉綠素 ａ的一部分，從而導(dǎo)致 ｂｂｅ法測定數(shù)據(jù) 低于分光光度法。而且，本研究 使用的 ｂｂｅ法能減少黃色物質(zhì)（即有色可溶性有機(jī) 物，ＣＤＯＭ）的影響，導(dǎo)致 ｂｂｅ法數(shù)據(jù)比分光光度法 偏低。ＣＤＯＭ存在于所有自然水體中，是溶解性有 機(jī)物的重要組成部分， 在紫外短波光的激發(fā)下會發(fā)出長于吸收光波長的熒 光；ＣＤＯＭ的吸收還延展到可見光 的藍(lán)光部分，與浮游植物葉綠素 ａ和非生物懸浮顆 粒物的吸收重疊，從而影響水體初級生產(chǎn)力（。有研究表明，在沿岸水 域，若忽略了黃色物質(zhì)的影響，將使葉綠素濃度下降 ３５％ ～６０％。

3.2水文條件對 ２種方法測定結(jié)果的影響

   比較 ３個(gè)樣點(diǎn) ２種方法的周年葉綠素 ａ測定結(jié) 果，Ｓ１點(diǎn)相關(guān)性偏低，特別是 ２００９年 ８月和 ２０１０ 年 ４－５月分光光度法的測量值要明顯高于 ｂｂｅ法。 Ｓ１點(diǎn)位于新安江來水方向的zui前沿，屬于河道型的 環(huán)境，因此水流要強(qiáng)于其他區(qū)域。在 ２００９年 ７月末 和 ２０１０年 ３月，該流域經(jīng)歷過大面積的降雨，因此 過水量增加，水位升高，水體流速變快。由于我們所 使用的分光光度法采樣時(shí)定深是依靠所釋放的纜繩 的長度來衡量的，所以在水流比較急的情況下，對于 深度的定位偏差較大，所采水層可能并未達(dá)到目標(biāo) 深度，而較淺處通常情況下光照條件更好，浮游植物 生物量和葉綠素含量都較高些；ｂｂｅ法采用的是壓 力定深，每次使用前還根據(jù)當(dāng)時(shí)的大氣壓力進(jìn)行校 ８２ 第３４卷第 ２期 水 生 態(tài) 學(xué) 雜 志 ２０１３年 ３月準(zhǔn)，因此深度定位是比較準(zhǔn)確的，不會受到水流的影 響。所以，在這 ２個(gè)時(shí)期，由于水文條件導(dǎo)致的采樣 誤差，致使分光光度法的結(jié)果與 ｂｂｅ法結(jié)果有較大 的差異，也說明分光光度法在采樣過程中存在流水 中深度定位不準(zhǔn)的瑕疵，不適于河流等水體擾動(dòng)較 大和采樣平臺不穩(wěn)定的水體環(huán)境。Ｓ４點(diǎn)和 Ｓ９點(diǎn)是 靜水區(qū)，風(fēng)浪水流均較小，雖然分光光度法的測定值 偏大，與 Ｇｒｅｇｏｒ等（２００４）的研究結(jié)果相似，但 ２種 方法的測定結(jié)果相關(guān)性較高，Ｒ值接近。 最后需要指出的是，盡管低濃度組和中濃度組 ２種方法測得的葉綠素 ａ含量的相關(guān)性均達(dá)到了顯 著水平，但均較明顯地低于全濃度組，可能與劃分濃 度組后，各濃度組的變異范圍即變化尺度變小有關(guān)。 低濃度組的相關(guān)性下降比較多，可能是濃度低組人 為測定誤差對數(shù)據(jù)的“貢獻(xiàn)”大于高濃度組，對相關(guān)性的影響較大。