組織培養(yǎng)技術(shù)

       組織培養(yǎng)技術(shù)是在人為創(chuàng)造的無(wú)菌條件下將生物的離體器官（如根、莖、葉、莖段、原生質(zhì)體）、組織或細(xì)胞置于培養(yǎng)基內(nèi)，并放在適宜的環(huán)境中，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)以獲得細(xì)胞、組織或個(gè)體的技術(shù)。這種技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和生物、醫(yī)藥的研究。

       體內(nèi)組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似，但由于物種、個(gè)體遺傳背 景及所處發(fā)育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養(yǎng)技術(shù)措施 亦不盡相同，現(xiàn)介紹主要組織細(xì)胞培養(yǎng)的要點(diǎn)如下：

       上皮細(xì)胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細(xì)胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細(xì)胞培養(yǎng)中?；祀s有成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速度往往超過(guò)上皮細(xì)胞，并難以純化，同時(shí)上皮細(xì)胞難以在體外長(zhǎng)期生存，因此純化和延長(zhǎng)生存時(shí)間是培養(yǎng)關(guān)鍵。體內(nèi)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在膠原構(gòu)成的基膜， 因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長(zhǎng)， 另外人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以 3T3 細(xì)胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時(shí)，細(xì)胞易生長(zhǎng)并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低 PH、Ca2+含量和溫度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子，均有利于表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。以表皮細(xì)胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細(xì)胞，

       內(nèi)皮細(xì)胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細(xì)胞，對(duì)于研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞再生、腫瘤促血管生長(zhǎng)因子（TAF）等有很大價(jià)值。       研究人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法尤為簡(jiǎn)便，其法如下：

       1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無(wú)菌剪取 10—15 厘米長(zhǎng)一段，如不能立即培養(yǎng)，可于12小時(shí)內(nèi)保存于 4℃。

       2、用三通注射器吸取溫 PBS 液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊， 以防液體返流。

       3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入濃度為 0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化 3—10 分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

       4、吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS 輕輕反復(fù)沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復(fù)） 。

       5、離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見細(xì)胞長(zhǎng)成單層。

       神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元）不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時(shí)，可出現(xiàn)一定程度的分化，長(zhǎng)出突起等現(xiàn)象， 但很難使之增殖。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長(zhǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞，也可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。一般說(shuō)來(lái)，膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長(zhǎng)不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉(zhuǎn)化，但對(duì)外界因素仍保持很好的敏感性，可用 ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。

       一．設(shè)備：無(wú)菌操作設(shè)備。

       二．大型設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱：恒溫5%、10%CO2維持培養(yǎng)液中pH值。        

倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

解剖顯微鏡：用于準(zhǔn)確地取材。

常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養(yǎng)液，解剖液和鼠尾膠。

低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲(chǔ)存血清酶，貴重物品和試劑。

電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。高壓消毒鍋：用于消毒培養(yǎng)皿，手術(shù)器械。

過(guò)濾器：配制解剖液、培養(yǎng)液，必須過(guò)濾后才可使用，以去除細(xì)菌。

滲透壓儀：pH劑，天平等。

       三．培養(yǎng)器皿及手術(shù)器械

1.培養(yǎng)皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。

2.培養(yǎng)板：24-40孔，可用于開放培養(yǎng)。

3.培養(yǎng)瓶；

4.吸管：常用1，5，10mL，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。

5.各類培養(yǎng)液貯存器。

6.小型手術(shù)器械。

       準(zhǔn)備

       一.配制培養(yǎng)液

（1）解剖液：以無(wú)機(jī)鹽（去除Ca2+, Mg2+ ）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。

（2）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。

（3）接種培養(yǎng)液：用于胰酶消化后的細(xì)胞分散，做成細(xì)胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當(dāng)天配制。

（4）維持培養(yǎng)液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

       二.培養(yǎng)基質(zhì)

常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再涂膠。

       三.消毒培養(yǎng)皿的備用

所有培養(yǎng)器皿均需清水沖洗2-3d，達(dá)兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養(yǎng)前1天進(jìn)行。

       神經(jīng)細(xì)胞分散培養(yǎng)

       （一）選材

       常用胚胎動(dòng)物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過(guò)也有認(rèn)為與組織相關(guān)。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚，則黑質(zhì)以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細(xì)胞成活率高，顆粒細(xì)胞正在分化；脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng)，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經(jīng)成活率高。

       （二）取材

       腦則取出相應(yīng)組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側(cè)，分別培養(yǎng)。

       （三）細(xì)胞分離與接種

       神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細(xì)口吸管吹打細(xì)胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，預(yù)置細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)皿（1×106），做電生理應(yīng)為5×105或更低。

       （四）抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)

培養(yǎng)3-5d后，也有人認(rèn)為培養(yǎng)7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)