病毒RNA純化試劑盒的應(yīng)用與操作步驟！

                病毒RNA純化試劑盒的應(yīng)用與操作步驟！

一、背景

病毒RNA純化試劑盒采用可以特異性結(jié)合病毒RNA的吸附柱和*的緩沖液系統(tǒng)，適用于從血清、血漿、尿液、腦脊液等無細(xì)胞體液及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離病毒RNA。病毒RNA特異性地結(jié)合到硅基質(zhì)膜上，而污染物則流過該膜。通過兩次高效洗滌*去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，然后用無RNase的水或試劑盒提供的RNase-Free Water洗脫高純度的病毒RNA。由本試劑盒提取的病毒RNA可直接用于RT-PCR、Real-time RT-PCR和印跡分析等實(shí)驗(yàn)。

二、操作步驟

1、室溫下取200μl血清或血漿加到1.5ml離心管(自備)中。

2、向上步溶液中加入20μl蛋白酶K，混勻。

3、加入200μl Buffer GL，渦旋震蕩15秒。

4、56℃孵育15分鐘，短暫離心，將管壁上的溶液收集到管底。

5、加入250μl無水乙醇，渦旋震蕩15秒，室溫孵育5分鐘，短暫離心，將管壁上的溶液收集到管底。

6、將步驟5得溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱中，若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請(qǐng)分兩次轉(zhuǎn)入，12000rpm(~～13400×g)離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7、向吸附柱中加入500μl Buffer RW1，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

8、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前檢查是否加入無水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

9、向吸附柱中加入500μl無水乙醇，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

10、12000rpm離心3分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以*晾干。

11、將吸附柱置于一個(gè)新的無RNase離心管中，向吸附柱的中間部位懸空加入20-50μl RNase-Free Water，室溫放置5分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

三、應(yīng)用

用于動(dòng)物RNA病毒反向遺傳系統(tǒng)的研究和建立研究：

SVDV HK／70株生物特性測(cè)定、生物信息學(xué)分析及以T7 RNAP為基礎(chǔ)的體外病毒拯救方法的建立和應(yīng)用為了建立以T7 RNA聚合酶系統(tǒng)為基礎(chǔ)的體外拯救病毒方法，選擇豬水泡病病毒（SVDV）HK／70株作為細(xì)胞質(zhì)復(fù)制的RNA病毒的研究模型。

首先，分離和鑒定了該病毒，并測(cè)定了該病的一些生物學(xué)特性。然后構(gòu)建了SVDV全長cDNA并進(jìn)行序列測(cè)定，以此為基礎(chǔ)，分析了其相關(guān)生物信息學(xué)特征。為了鑒定SVDV HK／70株的全長cDNA分子的感染性，以線化的SVDV HK／70株的全長cDNA質(zhì)粒(pSVOK12)為模板，應(yīng)用T7 RNA聚合酶系統(tǒng)在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，將獲得的RNA用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入IBRS-2細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，可以觀察到典型的SVDV致細(xì)胞病變效應(yīng)。

使用反向血凝鑒定試驗(yàn)、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)、RT-PCR和序列測(cè)定進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，從豬水泡病病毒全長cDNA拯救出了豬水泡病病毒（G-SVDV）；利用常規(guī)負(fù)染的方法，電鏡觀察了G-SVDV的形態(tài)；測(cè)定了G-SVDV的TCID50和LD50，并與親本毒進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示G-SVDV與親本毒的毒力差別不顯著。