污染，是PCR實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)假陽性、結(jié)果不可信的重要原因，PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)將防污染作為日常管理、實(shí)驗(yàn)安排、清潔消毒、實(shí)驗(yàn)習(xí)慣的核心。PCR 實(shí)驗(yàn)污染和細(xì)胞污染是有差別的，PCR 實(shí)驗(yàn)污染主要是核酸而不是細(xì)菌和其他入侵者。因此所有的預(yù)防措施都會(huì)稍稍有所不同?！耙撞椴灰撞臁?，污染來的悄無聲息，我們?cè)撊绾螒?yīng)對(duì)。今天給大家簡(jiǎn)單介紹一下PCR實(shí)驗(yàn)室的主要污染來源、實(shí)驗(yàn)中如何避免和減少污染的可能性及實(shí)驗(yàn)發(fā)生污染的應(yīng)急處理方案。

PCR實(shí)驗(yàn)室的污染來源

1、樣本間交叉污染：

收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴(yán)外溢；不同樣本移液時(shí)忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實(shí)驗(yàn)器具及耗材未及時(shí)消毒滅菌；不同樣本同時(shí)開蓋或樣本劇烈震蕩、反復(fù)吹吸導(dǎo)致氣溶膠形成擴(kuò)散，相互交叉污染。

2、實(shí)驗(yàn)試劑污染：

主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中，由于移液器、容器、陰性對(duì)照及其它試劑被核酸模板或陽性對(duì)照污染。 加樣過程中，因?yàn)?PCR 試劑對(duì)溫度十分敏感，需要通過冰浴使得 PCR 試劑和 PCR 板/管處于 0℃，但這個(gè)過程也是充滿了污染的風(fēng)險(xiǎn)的。

3、擴(kuò)增產(chǎn)物污染：

大量拷貝的產(chǎn)物泄漏或擴(kuò)增后的PCR反應(yīng)管意外開蓋，這是 PCR 反應(yīng)中最主要常見的污染問題。因?yàn)?PCR 產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 PCR 檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。

4、克隆質(zhì)粒污染：

作為陽性質(zhì)控品的克隆質(zhì)粒外溢。

PCR實(shí)驗(yàn)室的防污染方法

按照實(shí)驗(yàn)室的安全工作制度或安全標(biāo)準(zhǔn)操作程序，所有操作符合《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

1、嚴(yán)格執(zhí)行各區(qū)功能劃分：

試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。

標(biāo)本制備區(qū)：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管。對(duì)于涉及臨床樣本的操作，應(yīng)符合生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室防護(hù)設(shè)備、個(gè)人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。

擴(kuò)增區(qū)：cDNA合成、DNA擴(kuò)增及檢測(cè)。

擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測(cè)定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測(cè)序等。

試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)和擴(kuò)增區(qū)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)用品，包括移液器等器具應(yīng)專用，空氣、物品流向依次為：試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)，不可逆行。

2、清潔的實(shí)驗(yàn)用品：

實(shí)驗(yàn)室自配試劑（去離子水、緩沖液等）和所有使用器具在使用之前均應(yīng)高壓滅菌或紫外殺菌。槍尖、反應(yīng)管等實(shí)驗(yàn)耗材應(yīng)一次性使用。

3、正確的實(shí)驗(yàn)操作：

實(shí)驗(yàn)應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，工作臺(tái)內(nèi)應(yīng)放置PCR專用的微量離心機(jī)、各量程的移液器和其他必須物品。

實(shí)驗(yàn)的過程中選擇最合適尺寸的手套并能及時(shí)更換，在進(jìn)出不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域或進(jìn)行模板操作后都應(yīng)更換實(shí)驗(yàn)服、口罩、帽子及手套，以避免不同實(shí)驗(yàn)區(qū)交叉污染。

裝有PCR試劑的反應(yīng)管在打開之前應(yīng)先瞬時(shí)離心，將管壁及管蓋上的液體離至管底，降低污染手套或加樣器的風(fēng)險(xiǎn)；謹(jǐn)慎開啟反應(yīng)管，防止管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠導(dǎo)致污染。

吸加試劑和模板的操作應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)范要求進(jìn)行，遵守“慢吸快打”原則，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以避免氣溶膠產(chǎn)生的交叉污染。

PCR試劑建議小量分裝，以減少反復(fù)凍融、重復(fù)取樣次數(shù)；多樣本PCR反應(yīng)時(shí)，先配制反應(yīng)混合液分裝至反應(yīng)管中，最后加入樣本核酸，請(qǐng)勿同時(shí)開蓋，盡量保證單人單管，實(shí)現(xiàn)*閉管操作。

實(shí)驗(yàn)試劑應(yīng)與樣品和PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同處。

PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)完成后及時(shí)將反應(yīng)管取出，用一次性手套將產(chǎn)物反應(yīng)管包裹丟棄，保證管蓋緊閉。

4、規(guī)范的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的相關(guān)規(guī)定，實(shí)驗(yàn)中設(shè)立陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，全程質(zhì)控實(shí)驗(yàn)過程，驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，并協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性。

PCR實(shí)驗(yàn)室的污染應(yīng)急處理方法

1、若核酸樣本溢出：

立即用布或紙巾覆蓋，由外圍向中心傾倒10%的次氯酸消毒劑，約30分鐘后，清除污染物品，再用次氯酸消毒劑擦拭，并用75%酒精噴灑，移動(dòng)紫外車定點(diǎn)照射1小時(shí)。

2、其他不明情況污染：

1、暫停所有實(shí)驗(yàn)操作；

2、清理實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有物品，尋找污染來源；

3、加大實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)；

4、對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有表面（臺(tái)面、地面及墻面） 進(jìn)行消毒；

5、75%酒精空中噴霧；

6、開啟紫外消毒裝置，延長(zhǎng)紫外照射時(shí)間（4小時(shí)以上）；

7、以上措施每日進(jìn)行，直至污染消除；用新試劑及確認(rèn)無污染的器材進(jìn)行原污染項(xiàng)目的試劑空白檢測(cè)，連續(xù)3次均陰性后方可進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。