高光譜暗場成像用于胞嘧啶修飾位點的量化研究

表觀遺傳信息的調控和異常在眾多的生理、病理中起著至關重要的作用。胞嘧啶衍生物可以調控基因表達。但是，單細胞水平上遺傳信息標記物的定量評估受到了較低的時空分辨率和信噪比成像方法的限制。所以，很少有人對不同類型細胞和不同細胞階段的這些胞嘧啶修飾位點進行表征研究。
高光譜成像技術（Hyperspectral Imaging）有著*的空間分辨率和光譜分辨率，可以輕松獲得視野內上某一個像素點的光譜信息。暗場成像（Dark-Filed）的方式可以排除未散射的入射光束，得到清晰的背景。將高光譜成像技術與暗場成像方式相結合（Hyperspectral Dark-Field Imaging，HSDFI）可以確定生物組織中等離子體納米顆粒的位置和成分。2015年，美國普渡大學JosephIrudayaraj課題組在《ACS Nano》上發(fā)表文章“Single-CellQuantification of Cytosine Modifications by Hyperspectral Dark-Field Imaging”，提出了一種在單細胞水平上檢測胞嘧啶修飾位點的方法。具體內容如下：

等離子體納米探針用于胞嘧啶修飾的檢測

作者選用DNA修飾的一抗和包含AuNPs和AgNPs的二抗來平衡空間位阻，結合效率和信噪比。等離子體納米探針具有較大的局部表面等離子體共振（Local Surface Plasmon Resonance，LSPR）散射截面，這些納米探針作用于胞嘧啶的修飾位點會產生強信號。通過分析LSPR光譜特征和信號強度，可以得出等離子體納米探針的數量和局部濃度，進而對單細胞內胞嘧啶修飾位點的平均數量和區(qū)域分布進行量化。AuNPs的LSPR峰位于537nm附近呈現綠色，AgNPs位于419nm附近呈現藍色。這組體外光學實驗驗證了這組納米粒子用于檢測DNA上胞嘧啶修飾位點的可行性（圖1，圖2）。


圖1：胞嘧啶修飾位點的成像和量化示意圖；（a）抗體修飾胞嘧啶位點原理圖；（b）單細胞內胞嘧啶修飾位點和局部修飾的濃度的高光譜信息

圖2：AuNPs和AgNPs的高光譜暗場成像和光譜表征示意圖

單細胞內胞嘧啶修飾位點的量化

對胞嘧啶修飾位點進行檢測可以評估量化效率。作者檢測了5caC的細胞周期依賴性豐度。盡管在體細胞中，5mC的圖像可以在新合成的DNA鏈上重建，但是目前還不清楚其他改性的胞嘧啶的豐度是否也能在“后代”中穩(wěn)定的遺傳。因此，作者進行了實驗來評估不同細胞階段的5caC水平。研究表明，5caC在G2M階段的含量是G1的兩倍。單個染色體上的5caC的局部濃度也可以用HSDFI進行繪制，5caC在著絲粒處的密度明顯高于端粒處，重構的光譜圖也進一步證實了細胞核和單個染色體上的5caC的密度（圖3）。

圖3：5caC在MCF-7細胞的不同階段的成像和量化；（a）樣品細胞在G2/M階段和G1階段的高光譜暗場圖像；（b）不同細胞期5caC的數量；（c）5caC在單條染色體分布的高光譜暗場圖像；（d）端粒和著絲粒上納米探針的LSPR譜圖；（e）5caC在單條染色體上分布的熒光成像；（f）5caC在細胞核和單條染色體上的光譜重建圖像

HSDFI精確性的驗證

為了證明HSDFI的精確性，作者選用兩種細胞系對胞嘧啶的修飾位點進行了實驗（5caC在HeLa細胞和SF767細胞，5fC在HeLa細胞），并使用HSDFI的濾波功能可以對胞嘧啶改性的DNA進行量化。研究表明，5caC在SF767細胞和Hela細胞的比值約為1.97，SF767細胞中5caC水平高于5fC，比值約為1.56，這些結果說明了5caC比5fC更穩(wěn)定（圖4）。

圖4：HSDFI的濾波功能可以實現胞嘧啶修飾的精確量化；（a）利用HSDFI的濾波功能對原始圖像進行優(yōu)化；（b）不同細胞納米粒子的高光譜圖像和數量

胞嘧啶修飾位點的多重檢測

為了評估HSDFI用于多重檢測的有效性，作者選用30nm的AuNPs和20nm的AgNPs進行了實驗。根據散射光的顏色和光譜特征來區(qū)分納米探針（綠色為AuNPs，藍色為AgNPs）。納米粒子的位置信息和相互作用可以用HSDFI成像技術來分析。高光譜圖像上AgNPs和AuNPs的LSPR峰位沒有發(fā)生偏移，納米粒子之間的間距約為1 nm，說明AuNPs和AgNPs沒有發(fā)生耦合和團聚，耦合之后的峰形明顯的偏移。這些結果表明HSDFI可以評估表觀遺傳修飾位點的數量和相互作用（圖5和圖6）。

圖5：AuNPs和AgNPs的表征；（a）納米粒子的暗場成像；（b）AgNPs和AuNPs的紅外譜圖

圖6：細胞中5caC和5mC的檢測；（a）5caC和5mC的高光譜圖像；（b）a圖中圈內三個點的光譜信息；（c）b圖中的模擬光譜圖；（d-g）光譜譜線信息的二維圖像

總結：作者進行一系列的實驗證明了HSDFI可以在單細胞水平上對多重表觀遺傳標記的修飾位點進行量化和成像。這是單細胞表觀遺傳學定量領域的shouci嘗試之一，為未來臨床診斷中更全面的細胞分析和組織評估奠定了基礎。
參考文獻
[1] X, Wang, Y. Cui, and J. Irudayaraj. Single-CellQuantification of Cytosine Modifications by Hyperspectral Dark-Field Imaging[J]. ACS Nano, 2015, 9(12): 5b04451.