從一個(gè)有趣的案例看選擇性的重要性

在HPLC方法開(kāi)發(fā)中，分離度達(dá)不到要求是我們常遇到且需要解決的問(wèn)題。對(duì)于這個(gè)問(wèn)題，已經(jīng)有非常多的研究。經(jīng)典的理論模型是1999年由Zhao等人提出，如下圖中的公式所示，分離度由柱效、選擇性和保留因子決定。從圖中的擬合曲線(xiàn)可以看出，改變選擇性是改善分離度的最容易出奇制勝的方法。

圖1 分離度及其決定因素圖

那么，什么是選擇性呢？簡(jiǎn)單、通俗的理解是化合物在特定的色譜條件（固定相、流動(dòng)相和溫度等）下，與固定相和流動(dòng)相的作用總和的差異，差異越大，選擇性也就越大，對(duì)分離度的改善也越大。星譜實(shí)驗(yàn)室完成了一個(gè)非常有意思的類(lèi)似物的分析方法開(kāi)發(fā)，可以展示選擇性的重要性，為我們方法開(kāi)發(fā)工作提供啟發(fā)。待分離的三個(gè)化合物（A，B，C）的結(jié)構(gòu)如2所示：

圖2 三個(gè)待分析物的結(jié)構(gòu)

我們分析并用紅色標(biāo)記了三個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)上基團(tuán)的差異以及這些基團(tuán)可能與固定相和流動(dòng)相之間發(fā)生作用力，如圖3所示：

圖3 三個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)差異及差異基團(tuán)的作用力

從圖3可以看出，三個(gè)化合物之間存在氫鍵，偶極-偶極和pi-pi作用的差異，因此可以基本確定判斷：

1. 當(dāng)以甲醇和乙腈作為有機(jī)相時(shí)，選擇性的差異會(huì)比較明顯；

2. 由于化合物中的基團(tuán)（包括R1和R2）在常用色譜柱的耐受的pH范圍內(nèi)都是非電離狀態(tài)，因此無(wú)需過(guò)多考察流動(dòng)相的pH；

3. 可以選擇能夠識(shí)別這些差異的色譜柱來(lái)優(yōu)化分離；

4. 這些基團(tuán)本身的疏水性也有差異。

因此，我們以C18柱為色譜柱選擇的起點(diǎn)，選用Horizon C18這款經(jīng)典的色譜柱，考察甲醇和乙腈作為流動(dòng)相中的強(qiáng)溶劑時(shí)的分離情況，結(jié)果如圖4所示：

圖4 考察乙腈和甲醇作為流動(dòng)相強(qiáng)洗脫溶劑的圖譜

從分離結(jié)果中可以看出，在兩種溶劑中，三個(gè)化合物體現(xiàn)出了非常大的選擇性差異，總體在甲醇中三者的分離效果更好。我們通?？赡軙?huì)在此基礎(chǔ)上，用Horizon C18，通過(guò)調(diào)節(jié)甲醇的比例來(lái)優(yōu)化方法，實(shí)現(xiàn)三者的分離。但是對(duì)于這三個(gè)化合物，我們進(jìn)行多次甲醇比例的優(yōu)化仍然無(wú)法獲得三者足夠安全的分離度，如圖5所示：

圖5 使用Horizon C18考察不同比例的甲醇的圖譜

接下來(lái)我們從色譜柱固定相的選擇性的角度來(lái)考慮選擇能夠識(shí)別這三個(gè)化合物的差異的色譜柱，我們選擇了Horizon C18/PFP（C18和PFP同時(shí)鍵合，可以提供C18的作用的同時(shí)還可以提供PFP的pi-pi作用和氫鍵作用（受體）和偶極-偶極作用）以及Horizon C18/AR (C18和Phenyl同時(shí)鍵合，可以提供C18的作用的同時(shí)還可以提供Phenyl的pi-pi作用)，選擇和Horizon C18同樣的流動(dòng)相，結(jié)果如下：

圖6 考察三款選擇性互補(bǔ)的色譜柱的譜圖

可以看到，Horizon C18/AR相對(duì)C18，可以改善A和B的分離，而Horizon C18/PFP可以進(jìn)一步改善A和B的分離，不得不驚嘆色譜柱選擇性的威力！在這個(gè)基礎(chǔ)上，我們實(shí)驗(yàn)室很快就開(kāi)發(fā)出了足夠穩(wěn)健的分析方法。

圖7 Horizon C18/PFP和C18/AR所能提供的作用力匯總

全文總結(jié)

我們通過(guò)對(duì)三個(gè)有趣的化合物的HPLC分析方法開(kāi)發(fā)，剖析化合物之間的基團(tuán)差異以及這些差異帶來(lái)的可能的作用力的差異，通過(guò)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，也展示了流動(dòng)相（甲醇和乙腈）和色譜柱固定相的選擇性的重要性。希望可以給我們做方法開(kāi)發(fā)的用戶(hù)朋友帶來(lái)啟發(fā)。