植物基因組提取試劑盒的用途與合成方法！

                  植物基因組提取試劑盒的用途與合成方法！

一、背景

本試劑盒采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和*的緩沖液系統(tǒng)，能提取多種植物細胞/組織中的基因組DNA。離心吸附柱可以高效、專一吸附DNA，可限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物。提取的基因組DNA片段大，純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。

二、適用范圍

使用本試劑盒回收的DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、文庫構(gòu)建、Southern雜交等實驗。

三、保存條件

本試劑盒在室溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年；更長時間的保存可置于2–8℃。2–8℃保存條件下，若溶液產(chǎn)生沉淀，應(yīng)在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。單獨包裝的RNaseA收到后-20℃保存。

四、純度檢測

基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。可配制0.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應(yīng)在23kb以上。使用分光光度計檢測時，OD260/OD280比值應(yīng)為1.7–1.9之間，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。

五、準備工作

1、準備液氮；65℃水浴；無水乙醇；1.5ml滅菌離心管。

2、按照標簽所示在緩沖液AP3和漂洗液PW中加入無水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?/span>

3、每次使用前請檢查緩沖液AP1，緩沖液AP2和緩沖液AP3是否有沉淀生成，如果出現(xiàn)沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。

六、操作步驟

如非指出，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

1、取適量植物新鮮組織500mg-1g加入液氮充分研磨，取約100mg粉末置于1.5ml離心管中，加入400 μl 緩沖液AP1和6 μl RNaseA (10mg/ml)，漩渦震蕩1分鐘。

2、將離心管放在65℃水浴10分鐘，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次。

3、加入130 μl 緩沖液AP2，顛倒混勻，冰浴5分鐘。

4、12,000rpm離心5分鐘。

注：此步驟離心去除去垢劑，蛋白以及多糖等雜質(zhì)。

5、取上清（通常為400 μl）轉(zhuǎn)移到過濾柱CF中，12,000rpm 離心1分鐘。

6、將濾出液轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，加入1.5倍體積（例如400 μl的上清液加600 μl緩沖液AP3）緩沖液AP3（使用前請注意是否已經(jīng)加入無水乙醇），立即顛倒混勻，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

7、吸取步驟6中的混合液加入到吸附柱CG中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放回收集管中。

注：離心吸附柱的容積是700μl，如果一次不能*上柱，可以分次上柱離心，保證全部溶液全部加到離心柱中。

8、向吸附柱CG中加入500 μl漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

9、重復(fù)步驟8。

10、可選步驟：如果離心柱的吸附膜上有顏色，向吸附柱CG中加入500 μl無水乙醇，12,000 rpm離心1分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

11、將吸附柱CG放回廢液收集管中，12,000 rpm離心2分鐘。

注：此步驟非常重要，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實驗。

12、將吸附柱CG轉(zhuǎn)入一個干凈的1.5ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-100 μl經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，12,000 rpm g離心2分鐘。

注；1.洗脫緩沖液體積不少于50 μl，體積過小影響回收效率。

2.洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會降低洗脫效率。

13、DNA產(chǎn)物-20℃保存。