熒光及可視化 RT-LAMP 擴(kuò)增試劑盒簡(jiǎn)介

產(chǎn)品及特點(diǎn)

本產(chǎn)品是根據(jù)本公司的雙染料 RT-LAMP 技術(shù)開(kāi)發(fā)的熒光和可見(jiàn)光雙模式檢 測(cè)試劑盒 ，它既可以用于熒光 RT-LAMP 擴(kuò)增及檢測(cè) ，也可以用于可視化 RT-LAMP 擴(kuò)增及檢測(cè) ，適用于各種針對(duì)核酸的快速定性檢測(cè)。  本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：

1.   含可見(jiàn)光和熒光染料，  既可以用金屬浴和水浴擴(kuò)增用可見(jiàn)光肉眼判斷結(jié)果 ，也可

用熒光 PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。

2.   內(nèi)含的 dUTP-UNG 可防交叉污染。

3.   特異性比 RT-PCR 高，  因?yàn)?RT-LAMP 擴(kuò)增使用 4-6 條引物而不是兩條。

4.   靈敏性可達(dá) 10 拷貝/反應(yīng)以下  (隨引物而不同)  ，故假陰性率更低。

5.   只可用于科研 ，只可進(jìn)行定性檢測(cè) ，不能用于定量檢測(cè)。

自備 RNA 模板

總 RNA

或 poly(A) mRNA

或?qū)Ｒ坏?/span> RNA

注意 ：RNA 樣品不能有基因組 DNA 污染。

100-500 ng

10-500 ng

0.01pg-500ng

鐘在 FAM 通道采集一次熒光信號(hào)。

13. 如果使用 PCR 儀、金屬浴或水浴進(jìn)行擴(kuò)增，再使用 qPCR 儀進(jìn)行終點(diǎn)法熒光讀數(shù)： 則在擴(kuò)增前和擴(kuò)增后，分別在 qPCR 儀器上測(cè)熒光讀數(shù)(溫度設(shè)為 60-65 ℃，  1 次循環(huán)，每次循環(huán) 1 分鐘，在 FAM 通道采集一次熒光信號(hào)。注意：  測(cè)熒光讀數(shù)必 須在 65℃進(jìn)行)  。擴(kuò)增反應(yīng)按 60-65 ℃ ，90 分鐘進(jìn)行。

四、   結(jié)果分析及解讀

14. 如果是用普通 PCR 儀器、水浴或金屬浴進(jìn)行的擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后只能肉眼判斷結(jié) 果。將反應(yīng)管放置在白色背景(如白紙) 前觀察。擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照管內(nèi)反應(yīng)液將呈現(xiàn) 藍(lán)色，無(wú)模板和無(wú)引物的陰性對(duì)照將呈淺藍(lán)色。如果擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照管內(nèi)反應(yīng)液不呈 現(xiàn)藍(lán)色，或無(wú)模板和無(wú)引物的陰性對(duì)照任何一個(gè)呈現(xiàn)藍(lán)色，則說(shuō)明試劑有問(wèn)題， 實(shí) 驗(yàn)無(wú)效。請(qǐng)跟廠家聯(lián)系。

15. 如果實(shí)驗(yàn)有效，  則分析 N+2 個(gè)樣品管的結(jié)果。如果樣品管反應(yīng)液的顏色接近擴(kuò)增 陽(yáng)性對(duì)照管則說(shuō)明有擴(kuò)增，如果接近無(wú)模板和無(wú)引物的陰性對(duì)照，  則說(shuō)明無(wú)擴(kuò)增。 反應(yīng)結(jié)果示例見(jiàn)左圖(9 為陰性，  10 為陽(yáng)性)  。

16. 如果是用熒光 PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增， 則可分析擴(kuò)增曲線和 Ct。試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照 的 Ct 將小于 60，如果大于 60，說(shuō)明試劑可能失效，  需跟廠家聯(lián)系。無(wú)模板陰性 對(duì)照和無(wú)引物陰性對(duì)照的 Ct 將大于 90。如果任何小于 90，則說(shuō)明試劑或環(huán)境被 污染，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)或跟廠家聯(lián)系。如果陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照 Ct 都在正常范圍，則 分析樣品的 Ct。Ct 小于 60 的判斷為陽(yáng)性，大于 90 判為陰性，  在 60-90 之間則 需要重復(fù)檢測(cè)。

17. 如果使用 PCR 儀、金屬浴或水浴進(jìn)行擴(kuò)增，肉眼檢測(cè)，再使用熒光定量 PCR 儀 進(jìn)行終點(diǎn)法熒光讀數(shù)來(lái)判斷陰陽(yáng)性， 則先比較陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照樣品 擴(kuò)增后信號(hào)增幅應(yīng)該超過(guò) 100%，  陰性對(duì)照擴(kuò)增后信號(hào)增幅應(yīng)該低于 50%，否則 實(shí)驗(yàn)無(wú)效， 請(qǐng)與廠家聯(lián)系。如果兩個(gè)對(duì)照均有效，則比較樣品擴(kuò)增前后熒光讀數(shù)的 差值。如果擴(kuò)增后熒光信號(hào)增幅低于 50%，則判斷為陰性。如果熒光信號(hào)增幅高 于 100%，則判斷為陽(yáng)性。熒光信號(hào)增幅在 50- 100%之間的，  則需要重測(cè)。

18. 當(dāng)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)和可視化檢測(cè)同時(shí)用于判讀結(jié)果時(shí)，如果彼此不一致， 以實(shí)時(shí)熒光 LAMP 的數(shù)據(jù)為準(zhǔn)。一般可視化結(jié)果滯后實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)結(jié)果 20-30 分鐘，也就是 說(shuō)，在 qPCR 儀上第 30 分鐘時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性的樣品，  其反應(yīng)液的顏色變化一般在第

50-60 分鐘時(shí)才能觀察到。