植物過(guò)氧化物酶（POD）ELISA試劑盒 使用手冊(cè)

【產(chǎn)品名稱】

中文名稱：植物過(guò)氧化物酶（POD）酶聯(lián)免疫試劑盒

【包裝規(guī)格】

96T/盒

【預(yù)期用途】

僅供科研使用，本試劑盒用于測(cè)定植物組織，細(xì)胞及其它相關(guān)樣本中過(guò)氧化物酶（POD）活性。

【檢測(cè)原理】

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中植物過(guò)氧化物酶（POD）水平。用純化的植物過(guò)氧化物酶（POD）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入過(guò)氧化物酶（POD），再與HRP標(biāo)記的過(guò)氧化物酶（POD）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的過(guò)氧化物酶（POD）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中植物過(guò)氧化物酶（POD）活性濃度。

【產(chǎn)品性能】

1、物理性能

試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無(wú)沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無(wú)破損漏氣(如有漏氣，不影響使用）。

2、劑量反應(yīng)曲線線性

標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.9900。

3、檢測(cè)范圍

0.6 mU/L - 28 mU/L。

4、靈敏度

檢出劑量小于0.15 mU/L。

5、精密度

精密度用樣品測(cè)定值的變異系數(shù)CV 表示。CV（%） = SD/mean×100

批內(nèi)差：取同批次試劑盒對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量檢測(cè)，每份樣本連續(xù)測(cè)定20 次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD 值。

批間差：選取3 個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量測(cè)定，每個(gè)樣本使用同一試劑盒重復(fù)測(cè)定10 次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD 值。

批內(nèi)差： CV<6.8%

批間差： CV<7.2%

6、回收率

分別往5個(gè)不同樣本中添加已知濃度的目標(biāo)蛋白，做回收實(shí)驗(yàn)，得出回收率范圍和平均回收率。

7、線性

分別往5個(gè)樣本中添加已知濃度的目標(biāo)蛋白，做回收實(shí)驗(yàn)，得出回收率范圍及平均回收率。將5個(gè)樣本分別稀釋2倍，4倍，8倍，16倍做回收實(shí)驗(yàn)，得出回收率范圍及平均回收率

注意：使用前請(qǐng)檢查試劑盒中試劑的標(biāo)簽和數(shù)量與表格是否一致。

需要但未提供的材料及耗材

  1、酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）

2、精密移液器、吸頭、加樣槽

3、蒸餾水或去離子水

4、洗瓶或者自動(dòng)洗板機(jī)

5、37℃水浴鍋或恒溫箱

6、EP管

7、無(wú)粉一次性乳膠手套

【儲(chǔ)存條件及有效期】

  1、2-8℃保存，切勿冷凍，有效期6個(gè)月。

  2、開封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋，并將全部試劑放回2-8℃冰箱。

注意：試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸，按實(shí)驗(yàn)需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在實(shí)驗(yàn)后1 個(gè)月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過(guò)期時(shí)間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn)，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。

【適用儀器】

  半自動(dòng)的酶標(biāo)儀，如Thermo MK3，或者國(guó)產(chǎn)酶標(biāo)儀。

【樣本要求】

1.樣本類型和采集

血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置0.5-2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
    血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

細(xì)胞裂解液: 吸棄培養(yǎng)液，用PBS（0.01 M，pH 7.4）將細(xì)胞洗一遍。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞（不能用胰酶和EDTA 處理），加入2-5 mL PBS（0.01 M，pH 7.4）。懸浮細(xì)胞可省略。收集細(xì)胞懸液，4℃ 1000×g離心10min，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗3次。加入適量的預(yù)冷PBS或非變性細(xì)胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞,通常6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞量需要150-250μL PBS重懸。 將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞充分裂解,也可將樣品進(jìn)行超聲破碎，以達(dá)到裂解的目的。4℃ 10000×g 離心10min，除去細(xì)胞碎片，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.樣本保存和穩(wěn)定性

樣本在2-8℃條件下，可以儲(chǔ)存72h，在- 20℃或-80℃可以儲(chǔ)存6個(gè)月及以上。樣本收集后，不是一次檢測(cè)完，請(qǐng)按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融。