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休止細(xì)胞制備少不了離心機(jī)
休止細(xì)胞制備少不了離心機(jī)。
休止細(xì)胞反應(yīng)又稱靜息細(xì)胞,把培養(yǎng)液中各種營養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子洗去后懸浮在生理鹽水中培養(yǎng)一段時(shí)間，以消耗內(nèi)源營養(yǎng)物質(zhì)，呈呈饑餓狀態(tài)的細(xì)胞，在研究微生物的生理生化及新陳代謝中有廣泛的應(yīng)用。它的主要特性就是細(xì)胞雖然處于休眠狀態(tài)，不進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，但仍含有各種險(xiǎn)系，其有氧化和發(fā)酵能力，在適宜條件下可再恢復(fù)生長(zhǎng)。另外休止細(xì)胞反應(yīng)專一性強(qiáng),可以提高底物轉(zhuǎn)化率,不易染雜菌,可以減少產(chǎn)物對(duì)菌體生長(zhǎng)及醇合成的抑制。
培養(yǎng)基的制備及滅菌：
按實(shí)驗(yàn)材料中的培養(yǎng)基種類和數(shù)量配置相應(yīng)培養(yǎng)基，進(jìn)行滅菌。
菌種活化和擴(kuò)大化培養(yǎng)
將E.coli cVcc249保藏菌種轉(zhuǎn)接到試管*固體培養(yǎng)基斜面,37℃下培養(yǎng)18~24h.
選取長(zhǎng)勢(shì)良好的活化菌種轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)16~18h。
休止細(xì)胞的制備將三角瓶中的菌體倒入離心管中，4000rpm離心機(jī)離心15min，收集沉淀。
85%生理鹽水洗滌沉淀三次，每次4000rpm離心機(jī)離心15min。
用pH 7.0的磷酸緩沖液（PBS)20mL（用量根據(jù)使菌體數(shù)量而定）制備菌懸液，將制成的菌懸液放入4℃冰箱培養(yǎng)72hr，以降低內(nèi)呼吸，制得休止細(xì)胞。
底物的配制：
分別配制濃度為0.1M的四種底物:乙酸鈉、琥珀酸鈉、α -酮戊二酸鈉和檸檬酸鈉。按照需要進(jìn)行不同濃度梯度的稀釋。
酶與底物反應(yīng)：
在5mL的離心管中，加入0.4ml的休止細(xì)胞和0.4ml底物，37℃恒溫30min;加入40ul噻唑鹽，振蕩混勻，在37℃下反應(yīng).2hr;反應(yīng)完后，再離心管中加入1.5mL的二甲亞礬，混勻振蕩，并在37℃恒溫箱中保溫 30min;加入蒸餾水1.5ml。
測(cè)定OD510值：
按照分光光度計(jì)的使用說明，測(cè)定各個(gè)樣品的ODs1o值，并做好實(shí)驗(yàn)記錄。
整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中一定要無菌操作，尤其是活化菌株時(shí)，因?yàn)樗玫呐囵B(yǎng)基為*培養(yǎng)基，一般的微生物也能生長(zhǎng)，為確保所測(cè)得的脫氫酶活性是來自于保藏菌種的，所以第一步活化菌種時(shí)一定要確保無菌操作。
嚷唑鹽必須避光保存，因其見光易分解。另外，由于噻唑鹽和二甲基亞礬都有毒性，再加入這兩種試劑時(shí)，需戴手套進(jìn)行操作。
休止細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作在洗滌細(xì)胞時(shí)，每次懸浮務(wù)必充分，否則容易造成洗滌不干凈，導(dǎo)致有殘存的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致休止細(xì)胞的質(zhì)量不好。
在用分光光度計(jì)測(cè)量其OD值時(shí)，由于本實(shí)驗(yàn)中所用的分光光度計(jì)適合的測(cè)量范圍在0.2~0.7中，在測(cè)量前需檢測(cè)下樣品的OD值是否在這個(gè)范圍內(nèi)，如果過高，則加適量PBS稀釋。另外，在測(cè)量前，樣品需充分混勻，且動(dòng)作要快，以免甲瓚又結(jié)晶出來，影響測(cè)量的結(jié)果?？瞻讓?duì)照為蒸餾水。
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